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为探讨水牛干细胞多能转录因子OCT4、SOX2和NANOG基因上游序列的转录调控机制,本研究克隆三个多能转录因子基因的5’调控区序列,并构建不同长度的调控序列报告载体,在早期胚胎水平和细胞水平对各调控序列启动转录的活性进行了检测。1.设计特异性引物扩增克隆获得水牛OCT4基因5’调控序列,根据其CR4中2A和2B位点同源序列分布选取了-2571bp、-2389bp、-2338bp和-2191bp四个调控序列片段,并分别构建EGFP表达载体。然后应用各调控序列报告载体通过单精子胞质注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)生产转基因猪胚胎,4.5d后荧光显微镜下可见各调控序列均成功启动下游EGFP表达。但转染水牛胎儿成纤维细胞(buffalo fetal fibroblasts, BFF)48h后均未观察到荧光。QRT-PCR分析显示,在4.5d猪胚胎细胞中-2571bp片段活性极显著高于其它调控序列(P<0.01),-2389bp与-2338bp之间差异不显著(P>0.05),二者均极显著高于-2191bp(P<0.01)。2.设计特异性引物扩增克隆获得水牛SOX2基因5’调控序列。选取了-2263bp,-1816bp,-1275bp,-660bp和-407bp五个调控序列片段,并分别构建其EGFP表达载体。应用各调控序列报告载体通过ICSI生产转基因猪早期胚胎,4.5d后荧光显微镜下可见除-407bp片段以外的各调控序列均能启动EGFP的表达。转染BFF48h后,除-407bp片段未观察到荧光外,其他均可见少数细胞发光。QRT-PCR分析发现,在猪4.5d胚胎细胞中,随着片段逐步缩短,各调控序列活性呈极显著递减趋势(P<0.01)；而在BFF中,各调控序列活性差异均极显著(P<0.01),其活性从大到小依次为-2263bp、-660bp、-1275bp、-1816bp。3.设计特异性引物扩增克隆获得水牛NANOG基因5’调控序列。选取了-1213bp、-745bp、-425bp和-312bp四个调控序列片段,并分别构建其EGFP表达载体。应用p-1213-EGFP通过受精卵胞质注射生产转基因水牛囊胚,结果仅在内细胞团中观察到EGFP的表达。应用各调控序列报告载体通过ICSI生产转基因猪早期胚胎,4.5d后观察到各调控序列均成功启动下游EGFP的表达。转染BFF48h后均可观察到少数细胞发光。QRT-PCR分析发现,在猪4.5d胚胎细胞中各调控序列活性之间差异均极显著(P<0.01),其活性从大到小依次为-745bp、-425bp、-1213bp和-312bp；在BFF中则-425bp片段的活性极显著高于其它调控序列(P<0.01),-1213bp与-745bp之间无显著差异(P>0.05),二者都极显著高于-312bp片段(P<0.01)。上述结果表明,水牛OCT4翻译起始位点上游2191bp足以介导OCT4在多能细胞中的特异性表达；除-2389bp～-2338bp片段以外的CR4参与了猪4.5d胚胎中OCT4的转录调控。水牛SOX2基因翻译起始位点上游407bp～660bp是构成SOX2基本启动子不可缺少的部分；-660bp上游分布有潜在的多能细胞特异性和非多能细胞特异性增强子元件。水牛NANOG基因翻译起始位点上游1213bp在水牛囊胚中可以介导NANOG在内细胞团的特异性表达,其中同时分布有潜在的非多能性细胞特异性的调控元件。