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背景缺血性脑卒中可引起大量的神经元丢失和神经组织损伤,针对神经再生与重塑的疗法目前仍未达满意。骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)来源的外泌体(BMSCs-derived exosomes,BMSCs-exos)是当前此领域的研究热点,它可通过介导细胞间信号通讯调节脑组织损伤后内源性修复。然而由于体外制备的外泌体(exosomes)与BMSCs在体内所分泌exosomes存在一定差异,故其在治疗缺血性脑损伤的疗效方面仍存在一定不足;以川芎、当归组方的芎归方是治疗缺血性中风常用方剂,团队前期以芎归方开发的上市中成药舒脑欣滴丸(SNX)干预t MCAO模型大鼠,发现SNX具有促进神经细胞增殖及神经功能恢复等作用。蛋白组学及生物信息分析表明SNX可促进t MCAO大鼠损伤后72h皮质区胆碱能突触(Cholinergic synapse)和多巴胺能神经突触(Dopaminergic synapse)两条通路上的蛋白表达上调,提示SNX可能对损伤后的神经修复与突触重建有一定作用。芎归方是否可与BMSCs-exos协同改善脑内微环境,增强神经再生与神经功能修复,以及其具体作用的环节值得进一步探讨。目的以芎归方(SNX)协同BMSCs-exos干预t MCAO大鼠模型,评价其对缺血性脑损伤大鼠神经功能恢复的作用,并探讨其对神经再生与重塑的影响及干预环节。方法1.雄性SD实验大鼠分为假手术组(Sham)、模型组(t MCAO组)、芎归方组(t MCAO+SNX组)、BMSCs-exos组(t MCAO+exos组)、芎归方协同BMSCs-exos组(t MCAO+SNX+exos组)5组。运用线栓法建立大鼠t MCAO模型,造模成功的大鼠随机分为(1)t MCAO组,给予500μl PBS尾静脉注射,1次/2d,共4次;(2)t MCAO+SNX组,给予SNX 45mg/kg/d灌胃连续7天;(3)t MCAO+exos组,给予BMSCs-exos 400μg/kg尾静脉注射,1次/2d,共4次;(4)t MCAO+SNX+exos组,给药方案同t MCAO+SNX组及t MCAO+exos组。Sham组除未经插入线栓,其余手术操作及给药方法同t MCAO。每组n=10,于造模后24h给药。2.于造模后第1d、3d、7d、14d、21d测评各组大鼠体重、改良神经功能缺损评m NSS、平衡木实验、足部缺陷实验、掉线实验、转角实验,第7d、14d、21d测评各组大鼠转棒实验、旷场实验,第15d起连续6d测评各组大鼠水迷宫实验,以上实验评估缺血性脑损伤大鼠运动平衡与协调、肢体功能障碍、感觉功能障碍、焦虑抑郁、学习记忆能力等情况;体重评估总体生活状况;m NSS评估神经功能缺损程度。3.运用免疫荧光染色检测大鼠梗死侧纹状体Neu N~+/Brd U~+、DCX~+/Brd U~+、nestin~+/Brd U~+细胞表达情况;梗死侧海马区神经元轴突NF-200蛋白表达情况,梗死侧皮质区olig2~+/Brd U~+的表达情况;梗死侧海马区突触前囊泡突触素SYN蛋白及突触后膜致密物PSD-95蛋白的表达情况。4.高尔基染色(Golgi-Cox Staining)检测梗死侧大脑皮层运动代表区和内侧前额叶皮质区(Medial prefrontal cotex,m PFC)锥体细胞神经元的树突形态、分支及伸展长度及其表面棘状突起密度评估神经的可塑性和神经功能的活跃性。结果1.行为学评估(1)运动平衡与协调能力测评转棒实验:t MCAO组大鼠停留时间在第14d、21d与Sham组比较显著减少,差异有统计学意义(P<0.01);与t MCAO+SNX+exos组比较显著减少,差异有统计学意义(P<0.01),第21d与t MCAO+SNX组比较显著减少,差异有统计学意义(P<0.05);第21d t MCAO+SNX+exos组时停留时间与t MCAO+exos组比较差异有统计学意义(P<0.05);t MCAO+SNX+exos组与其余两治疗组间比较无统计学意义(P>0.05);平衡木实验:Sham组评分为0分;t MCAO组大鼠评分在第3d、7d、14d、21d,与t MCAO+SNX+exos组比较显著增高,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05),第3d、14d,与t MCAO+exos组比较显著增高,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05),第3d与t MCAO+SNX组比较显著增高,差异有统计学意义(P<0.01);t MCAO+SNX+exos组评分下降显著,第21d与其余两治疗组比,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)肢体功能障碍测评足部故障实验:Sham组评分为0分;t MCAO组大鼠评分在第14d、21d,与t MCAO+SNX组,t MCAO+exos组比较显著增高,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05),在第7d、14d、21d与t MCAO+SNX+exos组比较显著增高,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05);t MCAO+SNX+exos组各时间点与其余两治疗组比较差异无统计学意义(P>0.05);掉线实验:Sham组大鼠评分明显低于其他各组,在术后第1d、3d、7d、14d、21d与t MCAO组大鼠比较显著降低,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05);t MCAO组与3治疗组比较,无统计学差异(P>0.05);t MCAO+SNX+exos组与t MCAO+SNX、t MCAO+exos组比较无统计学差异(P>0.05)。(3)感觉功能障碍测评tMCAO组的右转百分比在第3d、14d、21d与Sham组比较显著增高,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05);在第14d、21d与t MCAO+SNX+exos组比较显著增高,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05);t MCAO+SNX+exos组与其余两治疗组比较未见明显差异(P>0.05)。(4)焦虑与抑郁现象测评从运动的总路程看,各组之间未见统计学差异(P>0.05);t MCAO组大鼠中央停留时间在第21d与Sham组比较显著延长,差异有统计学意义(P<0.05);与t MCAO+SNX组、t MCAO+SNX+exos组比显著延长,差异有统计学意义(P<0.01),与t MCAO+SNX+exos组比较第14d延长显著,差异有统计学意义(P<0.01),在第21d,t MCAO+SNX+exos组与t MCAO+SNX组比较显著减少,差异有统计学意义(P<0.05);t MCAO组大鼠站立次数在第21d与Sham组比较显著减少,差异有统计学意义(P<0.01),与t MCAO+exos组比较显著减少,差异有统计学意义(P<0.05);t MCAO+SNX+exos组各时间点与其余两治疗组比较未见明显差异(P>0.05)。(5)学习与记忆能力测评在前定位航行实验中,t MCAO组大鼠潜伏期在第3d、4d、5d与Sham组比较延长显著,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05);第3d、5d与t MCAO+SNX+exos组比较显著延长,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05);t MCAO+SNX+exos在第3d、5d时,与t MCAO+SNX组比较明显缩短,差异有统计学意义(P<0.05);在空间探索实验中,t MCAO组大鼠在目标象限停留时间与Sham组比较明显缩短差异有统计学意义(P<0.05);其余各组之间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。2.神经再生与重塑(1)神经元再生与tMCAO组比,3治疗组Neu N~+/Brd U~+、DCX~+/Brd U~+细胞数表达明显增多,差异具有统计学意义(P<0.01);t MCAO+SNX+exos组Neu N~+/Brd U~+、DCX~+/Brd U~+表达均明显增多,与其余两治疗组比,差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05);与t MCAO组比,t MCAO+SNX+exos组nestin~+/Brd U~+细胞数表达明显增多,差异具有统计学意义(P<0.01);t MCAO+SNX+exos组与其余两治疗组比较nestin~+/Brd U~+表达无明显统计学差异(P>0.05)。(2神经元突起生长及突触的重塑与tMCAO组相比,3治疗组NF-200、SYN、Olig2~+/Brd U~+表达均明显增多,分布较密集,形态规整,差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05);t MCAO+SNX+exos组Olig2~+/Brd U~+与PSD-95阳性细胞数明显增多,与其余两治疗组比较,差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05);SYN阳性细胞与t MCAO+exos组比较,t MCAO+SNX+exos组明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05),NF-200表达无明显统计学差异(P>0.05)。Golgi-Cox染色结果显示,在m PFC区,锥体细胞的树突长度及树突棘密度t MCAO+SNX+exos组较t MCAO+SNX组、t MCAO+exos组相比均显著增多(P<0.01,P<0.05),而在运动代表区虽依次存在增加趋势,但无统计学意义(P>0.05)。结论1.SNX+exos可以促进神经功能恢复,加强大脑功能重建。2.SNX+exos可以提升缺血性脑损伤大鼠运动平衡与协调能力,改善肢体功能障碍,缓解感觉功能障碍,调节焦虑抑郁状态,加强学习与记忆能力。3.SNX+exos可以促进神经元新生,调节突起生长及突触重塑。