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本试验用不同的方法体外培养马皮肤成纤维细胞,以其作为核供体构建了马体细胞一绵羊卵母细胞和马体细胞一牛卵母细胞两种重组胚,并对其早期发育进行了研究。
马皮肤成纤维细胞的分离培养:在37℃、5%CO<,2>、饱和湿度下,10%FBS的DMEM/F12培养液适宜于马皮肤成纤维细胞体外培养,小组织块直接培养法比酶消化法更易获得马皮肤成纤维细胞,经4次消化传代培养后,分离纯化了马皮肤成纤维细胞,并发现至少传至第10代时有76.3%的染色体还保持正常的二倍体倍性(2n=64)。
绵羊卵母细胞孤雌激活:绵羊卵母细胞在用离子霉素联合6-DMAP的化学激活时,其卵裂率为81.68%,囊胚发育率为34.43%,优于在激活电压1300v/cm,脉冲时间为10μsec,脉冲次数为2次,间隔0.5s的条件下,卵裂率为74.22%,囊胚率为29.69%的电激活效果。
经盲吸去核,带下注射结合电融合构建重组胚。两种重组胚在1580v/cm融合电压下,融合率和卵裂率最高:马-牛重组胚融合率为49.01%,卵裂率为55.65%;马-绵羊重组胚融合率为55.36%,卵裂率为58.06%。马-牛重组胚发育到早期桑椹胚,而马-绵羊重组胚发育到囊胚期,经胚胎染色体检查重组胚染色体数目和形态同马成纤维细胞染色体相同,说明马体细胞可以与绵羊的卵母细胞构建重组胚。