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水稻草状矮化病毒(以下简称水稻草矮病毒,Rice grassy stunt virus,RGSV),是纤细病毒属(Tenuivirus)的一个成员,病毒粒体丝状,由核衣壳蛋白和基因组RNA组成。该病于20世纪70年代曾在南亚、东南亚大面积发生,给当地的水稻生产造成严重损失,在我国的福建、台湾、广东、广西和海南等地也有分布。 与同属病毒其它成员相比,RGSV分子生物学研究进展较为缓慢,直至1998年才报道病毒基因组全序列,其基因组包含6个ssRNA片段,其中RNA1,2,5和6分别对应于纤细病毒属其它病毒的RNA1-4。6个片段均采用双义编码策略。这不仅在纤细病毒属中,在植物病毒中也是独特的。有鉴于此,本文对水稻草矮病毒沙县分离物(RGSV-SX)RNA1-3的分子生物学及部分基因功能进行了研究(RGSV-SX RNA1-3全长序列已递交GenBank登录,注册号分别为:AF509470、AF511072、AF397468)。 根据RGSV菲律宾北方分离物(RGSV-IR)序列设计合成引物,通过RT-PCR获得了覆盖RGSV-SX基因组RNA1-3的cDNA克隆。序列分析结果表明,RGSV-SX分离物RNA1长9764个核苷酸,与已发表的RGSV菲律宾IR、SC分离物相比,核苷酸序列同源性均为99.6%,其中,NS1蛋白三个分离物间的氨基酸序列同源性为100.0%、RdRP氨基酸序列同源性分别为95.0%、95.0%、99.0%;RNA2全长4071个核苷酸,RNA2与IR、SC分离物的核苷酸序列同源性分别为97.6%、99.3%,NS2氨基酸序列同源性分别为99.5%、99.0%,NSvc2氨基酸序列同源性分别为96.3%、96.9%;RNA3的全长为3120个核苷酸,整个片段与IR、SC分离物的核苷酸序列同源性分别为98.7%、91.0%,NS3氨基酸序列同源性分别为98.4%、96.4%,NSvc3氨基酸序列同源性分别为99.2%、81.9%。对RGSV各分离物(SX、IR、SC)间RNA1-6核苷酸序列同源性进行多重比较结果表明,RGSV存在明显的重排现象,不同分离物的相应RNA片段存在积累突变的差异。以RNA2、RNA3变异程度较大,SX的RNA2与IR变异较大,变异率达2.36%,更接近于SC分离物,而SX的RNA3-6则与IR分离物更接近,SX的RNA1与IR、SC有变异,但变异不大,且三个分离物间的变异主要发生在基因间隔区。这些结果表明,SX与IR同源性更高,二者具有较近的亲缘关系,而与SC的差异较大,这在分子水平上也进一步确定了SX 福建农林大学博!:学位论文2 与IR分离物相近,而与SC分离物相差较远,山此可以椎测,我国沙县分离 物 SX可能来源于菲律宾北方分离物(IR),并在流行过程中经介体昆虫传播二 发生了较少的基因内重排或变异。 对 RGSV七X的 VRNA3 ORF片段进行克隆、原核表达载体的构建及在大肠 杆菌中的表达,并制备了抗血清,为进一步开展NS3基因及它所编码蛋白的 功能研究打下基础。 通过建立水稻原生质体培养体系,经聚鸟氨酸(PLO)介导将提纯的水稻 草矮病毒(RGSV)接种到水稻原生质体内,按不同时间取样,提取其总蛋白, 以RGSV抗血清、制备的NS3融合蛋白抗血清及提纯的病害特异性蛋白SP(NS) 抗血清为探针,采用酶联免疫吸附法(ELISA)和蛋白免疫印迹法 (Western-blot),研究RGSV在水稻原生质体内的表达周期。 构建了含NAI基因的植物表达载体pCBTNSV3,转化农杆菌,用以转化水 稻的研究。在实验过程中详细比较了根癌农杆菌转化水稻的各种条件,建立 了农杆菌介导的水稻转化的优化系统,克服了再生植株难的问题,获得了转g RGSV NS3的水稻转基因再生植株,经鉴定,初步证实Ny基因已整合到水稻 的基因组中。