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中介蝮(Gloydius intermedius)属于蝰科蝮亚科(Crotalinae)毒蛇,广泛分布于我国西北及华北地区。其蛇毒富含多种蛋白质及酶,对其研究在治疗毒蛇咬伤、临床医学及药物开发等方面具有重要意义。蛇毒丝氨酸蛋白酶(Snake Venome Serine Proteases, SVSPs)是存在于蛇毒中的一种具有重要作用的蛋白水解酶,包括纤溶酶原激活剂(Plasminogen activator)、蛇毒纤维蛋白(原)溶酶、蛇毒类凝血酶(Snake venom thrombin-like enzyme)、蛋白C激活物、蛇毒凝血因子V激活剂、蛇毒凝血因子X激活剂、蛇毒血小板聚集激活剂7种,能广泛作用于血液凝结、血栓系统,能够影响凝血、促进血小板凝集、溶解血栓等。另外SVSPs之间在结构和蛋白序列上具有高度的同源性,但不同种类在外结合位点(exosite)具有不同的结构,因此它们具有各自特异性的底物并且表现出特定的生物活性。由于SVSPs在血液凝集,血栓溶解方面的作用,对其蛋白结构和功能活性的研究也就显得十分重要,也是研制出新的治疗心血管疾病药物的前提。本实验通过凝胶过滤层析和离子交换层析技术,从中介蝮蛇毒分离纯化获得了丝氨酸蛋白酶GI-SP2,并对GI-SP2的生物学活性进行了表征。实验的具体内容和结果如下：1. SVSP的分离纯化：(1)凝胶过滤层析：用葡聚糖聚丙烯酰胺凝胶Sephacryl-200HR装柱,以PH为8.0的50mmol/L碳酸氢铵(内含0.15mol/L NaCl及0.2g/L的叠氮钠)作为缓冲液,对中介蝮蛇粗毒进行分离,得到五个蛋白峰(P1-P5)。对分离得到的五个蛋白组分用Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐(N-benzoyl-D, L-arginine-p-nitroanilide, BApNa)为底物进行活性鉴定,结果显示P2、P3、P5三个组分具有明显的BApNa水解活性,其中P2的活性最高；SDS-PAGE电泳分析发现P2不是单一条带,需要进一步的分离纯化。(2)阴离子交换层析：利用HiTrap DEAE-FF阴离子交换层析预装柱对P2组份做进一步的分离纯化,整个体系以PH均为8.0的A液(50mmol/L碳酸氢铵)、B液(50mmol/L碳酸氢铵缓冲液,0.5mol/L NaCl)作为缓冲液,流速为0.2mL/min。上样后先用A液洗脱未与层析柱结合的蛋白,待穿透峰出来后,然后从A液到B液(100%)进行蛋白组分梯度洗脱。收集不同洗脱时段的峰组分,分别用底物BApNa检测其丝氨酸蛋白酶活性,结果表明P2-3、P2-4和P2-5组分都能作用于BApNa, P2-4的活性最高；对峰P2-4进行SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度,显示P2-4不是单一条带,混有杂蛋白,仍然需要进一步的分离纯化。(3)阳离子交换层析：利用HiTrap CM阳离子交换层析预装柱对阴离子交换所得P2-4组份进行再一次的分离纯化,体系以PH均为4.5的A液(50mmol/L醋酸钠)、B液(50mmol/醋酸钠,0.5mol/L NaCl)作为缓冲液,流速控制为0.2mL/min。上样后用A液洗脱未与层析柱结合的杂质,待穿透峰出来后,然后从A液B液(100%)设置梯度洗脱蛋白。最终得到两个蛋白峰,用BApNa为底物对其进行活性鉴定,发现P2-4-1活性明显高于P2-4-2；对P2-4-1进行SDS-PAGE电泳检测,发现P2-4-1为单一条带,表明获得了目的蛋白GI-SP2。2.对分离纯化得到的SVSP进行生物活性检测(1) GI-SP2对特异性底物BApNa的水解活性。(2)测定抑制剂对GI-SP2的酶活性的影响：在GI-SP2中分别添加p-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol, β-ME)、苯甲基磺酰氟(PhenylmethanesμLfonyl fluoride, PMSF)、乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid, EDTA),设不添加抑制剂组为阳性对照,通过超微量微孔板分光光度计测定GI-SP2与特异性底物BApNa的反应。数据显示GI-SP2对BApNa的水解活性可被PMSF显著抑制,EDTA对其活性无影响。表明GI-SP2不是蛇毒金属蛋白酶,属于SVSPs。(3) GI-SP2对纤维蛋白原(Fg)水解活性：GI-SP2组分和纤维蛋白原混合,取不同时间段的产物进行SDS-PAGE检测,发现GI-SP2主要水解纤维蛋白酶的p链。(4)小鼠尾巴流血时间测定：实验选择昆明系小鼠,给其尾静脉注射0.3μg/g的GI-SP2,以生理盐水为对照。结果表明GI-SP2能够使小鼠尾部静脉的流血时间得到明显的延长。(5)小鼠出血活性测定：实验选择昆明系小鼠,设置不同的GI-SP2剂量梯度,利用皮下注射的方式处理生理状况相同的昆明系小鼠,待24h后处死,剥下其背部皮肤,检查是否有出血现象产生。结果显示注射GI-SP2剂量高达50μg的小鼠,其皮下都没有血斑出现,说明分离所得的GI-SP2无出血活性。(6)类凝血酶活性：将分离所得GI-SP2与纤维蛋白原溶液均匀混合,置于37℃培养箱培养,设置凝血酶为阳性对照,观察有无白色沉淀的生成。结果表明,GI-SP2不是类凝血酶,它不能使纤维蛋白原溶液凝结。(7)纤溶活性：利用纤维蛋白原平板的方法,鉴定所得组分GI-SP2是否具有纤维蛋白活性。结果显示,GI-SP2可以水解纤维蛋白,具有纤溶活性。