人类C型尼曼匹克病(Niemann-Pick disease type C,NP-C)是一种罕见的,进展性的且不可逆的疾病,为常染色体隐性遗传,常导致神经系统功能缺失甚至早逝。95%患者是由于NPC1基因突变导致的胆固醇代谢障碍,另5%是NPC2基因突变所致。作为导致C型尼曼匹克病的主要因素,NPC1参与细胞内的胆固醇运输,编码位于溶酶体和核内体膜上的13次跨膜蛋白。NPC1突变的细胞内胆固醇异常堆积于核内体/溶酶体中。NPC1基因已经被发现有较多的功能,主要是:NPC1参与运输细胞内胆固醇;NPC1蛋白又被证实有跨膜分子泵活性;在针对于埃博拉病毒的研究中,NPC1蛋白被发现与埃博拉病毒感染细胞相关。以果蝇为例的昆虫中NPC1参与胆固醇运输外还被发现与蜕皮以及精子形成相关,且有两个直系同源物,NPC1a和NPC1b。而关于家蚕中NPC1基因功能尚无报道。为探索其在家蚕中功能,克隆得到了家蚕NPC1基因,并分析了其表达情况。之后制备了该基因的多克隆抗体。最后通过dsRNA干涉技术对BmNPC1基因的功能进行进一步的研究。主要研究结果如下:1.家蚕Bm NPC1基因全长克隆及信息分析利用家蚕基因组数据库和NCBI等数据库,对NPC1进行基本信息分析及比对并设计引物,BmNPC1的全长通过RACE技术获得。BmNPC1基因cDNA全长4591bp,其中ORF阅读框为3702bp,位于第三号染色体上。编码1233个氨基酸,蛋白大小为137.44kD,含有一个胆固醇结合结构域,且该蛋白13次跨膜。选取各物种的NPC1蛋白序列,构建系统发生树,结果显示BmNPC1与果蝇的NPC1亲缘关系最近。2.家蚕Bm NPC1的表达分析取家蚕五龄三天的所有组织和从四龄至熟蚕整个时期的家蚕血液,并用来提取cDNA作为模板,通过qRT-PCR检测BmNPC1的表达情况。结果表明,BmNPC1在五龄三天所有组织中表达,且在精巢、卵巢以及血液和马氏管中表达量比较高。在血细胞中的表达量与时期相关,当家蚕处于变态期时该基因大量表达。3.家蚕Bm NPC1抗体的制备及检测BmNPC1的多克隆抗体通过以下四步制备:构建重组的原核表达载体pET32,通过IPTG诱导蛋白的大量表达,在包涵体中的蛋白的纯化,以及5次小鼠免疫。最终获得了BmNPC1的小鼠多克隆抗体。利用ELISA测定抗体效价,之后Western blot检测获得的条带大小与BmNPC1预测的蛋白分子量一致。家蚕血液和家蚕细胞系(SID-1)的免疫荧光实验表明,与哺乳动物相同(NPC1蛋白定位于溶酶体膜和核内体膜),BmNPC1蛋白同样出现在细胞质中。表明抗体制备有效,可用的,为下一步实验做了良好的基础。4.利用dsRNA干涉技术研究Bm NPC1基因功能设计并合成双链干涉片段,细胞水平上通过双链干涉片段干涉SID-1细胞,FilipinⅢ染色发现细胞中胆固醇发生明显聚集,推测家蚕BmNPC1与细胞的胆固醇运输相关;个体水平上双链干涉片段注射蚕体,一定量的家蚕蜕皮推迟,另有一部分没有完成蜕皮并死亡,推测该基因与家蚕蜕皮过程相关。