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第一部分:TRPV4参与大鼠无菌性心包炎模型心房颤动的发生目的:建立稳定的大鼠无菌性心包炎心房颤动(房颤)模型,观察TRPV4在无菌性心包炎模型大鼠心房组织中的表达及功能变化。给予TRPV4 口服抑制剂GSK2193874治疗无菌性心包炎模型大鼠,观察房颤的发生率及持续时间有无变化。收集临床接受主动脉旁路移植术的房颤患者及窦性心律患者的心房组织标本,检测二者TRPV4表达有无差异,进一步明确TRPV4与房颤之间的关系。方法:在大鼠心房表面均匀播撒无菌性滑石粉,建立大鼠无菌性心包炎房颤模型。在手术后的不同时间点(1d,2d,3d,4d,5d,7d,14d),运用western blot技术,检测心房及心室组织TRPV4通道蛋白的表达变化。同时,采集各组大鼠心房组织做冰冻切片,进行免疫荧光染色,观察TRPV4通道的表达及分布有无变化。将SD大鼠随机分为3组:sham组;vehicle组(给予等量6%羟丙基-β-环糊精灌胃处理);GSK2193874组(给予TRPV4特异性阻断剂GSK2193874 10mg/kg灌胃治疗)。在手术后第3d,应用大鼠食道调搏技术,记录各组大鼠文氏点、窦房结恢复时间、房颤诱发率及房颤持续时间等指标,并比较各组之间有无差异。收集临床接受冠状动脉旁路移植术的窦性心律及房颤患者的心房组织,western blot技术检测二者心房TRPV4表达水平有无差异。结果:无菌性心包炎手术后第1d,2d,3d,4d,5d,7d,14d,大鼠心房组织TRPV4蛋白表达量持续高于sham组,在术后第1d达高峰;手术后第14d,TRPV4蛋白表达量有所下降,但依然显著高于sham组。各组大鼠心室组织TRPV4蛋白表达水平未见明显改变。免疫荧光结果显示,sham组大鼠心房组织TRPV4主要分布于细胞核周围,细胞膜上TRPV4表达很少;而无菌性心包炎模型组大鼠心房组织中,TRPV4在细胞膜上的表达量显著增多。电生理检测结果显示,vehicle组大鼠房颤持续时间与房颤诱发率显著高于sham组;GSK2193874组大鼠房颤的持续时间及诱发率则显著下降。临床患者心房组织检测结果显示,房颤患者心房组织TRPV4含量显著高于窦性心律患者。结论:TRPV4通道参与大鼠无菌性心包炎模型房颤发作,阻断TRPV4可有效抑制大鼠无菌性心包炎模型房颤发作;TRPV4可能参与临床房颤患者的病理进程,阻断TRPV4有望成为临床治疗房颤的新靶点。第二部分:阻断TRPV4可抑制大鼠心房成纤维细胞增殖及分化目的:心房纤维化参与房颤发生,TRPV4是否通过诱导心房纤维化进而参与房颤发作,至今尚未见相关研究报道。本实验拟通过利用大鼠无菌性心包炎房颤模型,探讨TRPV4在心房纤维化中的作用及其潜在的分子机制。方法:SD大鼠随机分为3组:sham组;vehicle组(给予等量6%羟丙基-β-环糊精灌胃处理);GSK2193874组(给予TRPV4特异性阻断剂GSK2193874 10mg/kg灌胃治疗)。于无菌性心包炎手术前1d,给予vehicle组及GSK2193874组大鼠体重比例的溶剂或阻断剂处理,持续至SP手术后第2d。SP手术后第3d处死大鼠,留取左、右心房标本备用。Real Time PCR技术检测各组大鼠心房组织纤维化相关指标TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、a-SMA的mRNA表达变化。Masson染色检测各组大鼠心房组织胶原含量,免疫组化染色检测心房a-SMA表达变化。Western blot技术检测大鼠心房组织纤维化相关信号通路蛋白STAT3、AKT/GSK-3心、ERK表达水平有无改变。分离培养各组大鼠心房成纤维细胞,使用多功能酶标仪检测TRPV4激动剂GSK1016790A引起的细胞钙离子内流有无差异。预先给予TRPV4通道特异性阻断剂GSK2193874孵育心房成纤维细胞,再观察GSK1016790A引起的钙离子内流有无变化。运用膜片钳技术记录各组大鼠心房成纤维细胞TRPV4通道给药前及给予GSK1016790A时的电流大小,比较两组心房成纤维细胞TRPV4电流有无差异。分离培养的大鼠成纤维细胞,阻断或激动TRPV4,RT-PCR检测纤维化相关指标TGF-β、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、a-SMA的mRNA水平有无变化;阻断AKT、STAT3信号通路,检测激动TRPV4后成纤维细胞上述纤维化指标有何变化。结果:Real Time PCR结果显示,vehicle组大鼠心房组织纤维化相关指标TGF-β、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、a-SMA的mRNA表达水平显著高于Sham组。Masson染色与免疫组化染色结果显示,Control组大鼠心房组织胶原及a-SMA含量显著高于Sham组。GSK2193874组大鼠心房组织纤维化指标的表达量显著降低。Western blot结果显示,vehicle组大鼠心房组织纤维化相关信号通路蛋白STAT3、AKT、GSK-3S的磷酸化水平显著高于sham组;阻断TRPV4后,GSK2193874组大鼠心房STAT3、AKT、GSK-3S蛋白的磷酸化水平显著降低,差异具有统计学意义;各组大鼠心房ERK表达水平未见明显改变。胞内钙检测结果显示,Vehicle组大鼠心房成纤维细胞对TRPV4激动剂GSK1016790A的反应性显著高于sham组。应用TRPV4特异性阻断剂GSK2193874预先处理细胞后,GSK1016790A引起的细胞内钙离子内流可被有效抑制。膜片钳结果显示,给予TRPV4激动剂灌注时,SP大鼠心房成纤维细胞TRPV4电流升高幅度显著高于sham组细胞。细胞实验显示,激动TRPV4后,成纤维细胞纤维化相关指标TGF-β、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、a-SMA的mRNA水平显著增高,而抑制TRPV4则可有效抑制纤维化指标的mRNA表达水平。此外,在细胞水平阻断AKT、STAT3通路,可有效抑制TRPV4激动引起的致纤维化效应。结论:无菌性心包炎模型大鼠心房成纤维细胞TRPV4功能增强,参与心房纤维化的形成;阻断TRPV4可有效抑制心房组织纤维化病理改变。TRPV4激活后,可能通过上调AKT/GSK-3β、STAT3磷酸化水平,促进成纤维细胞增殖分化及胶原合成,诱导心房纤维化,进而参与房颤发生。第三部分阻断TRPV4对无菌性心包炎模型大鼠心房电重构的影响目的:心脏电重构在房颤中的作用已经被明确,本部分实验拟通过大鼠无菌性心包炎模型,研究TRPV4在心脏电重构中的作用及其潜在的可能机制。方法:SD大鼠随机分为3组:sham组;vehicle组(给予等量6%羟丙基-β-环糊精);GSK2193874组(给予TRPV4特异性阻断剂GSK2193874 10mg/kg)。于无菌性心包炎手术前1d,给予vehicle组及GSK2193874组大鼠体重比例的溶剂或阻断剂灌胃处理,持续至手术后第2d。在手术后第3天,分离各组大鼠心脏并用Langendorff灌流系统进行灌流,使用MappingLab系统检测大鼠左心房在7Hz刺激下的传导速度及传导异质性。随后,记录大鼠右心房7Hz刺激下动作电位时程。所有检测完成后,留取大鼠心房组织标本:Western blot技术检测各组大鼠心房组织电传导相关蛋白缝隙连接蛋白43(connexin43)、小凹蛋白-3(caveolin-3)的表达变化;免疫组织化学染色法检测各组大鼠心房组织connexin43分布情况。结果:Mapping检测结果显示,vehicle]组大鼠心房组织传导模式紊乱,传导异质性显著增加;而阻断TRPV4后,GSK2193874组大鼠心房传导模式趋向正常,传导异质性显著降低。动作电位记录结果显示,vehicle组大鼠心房组织单向动作电位时程(APD)显著延长,阻断TRPV4后,GSK2193874组大鼠心房APD缩短至正常水平。Western blot结果显示,vehiclel组大鼠心房组织caveolin-3表达水平显著低于sham组,而GSK2193874组大鼠心房组织caveolin-3恢复至正常水平。免疫组化染色结果显示:sham组大鼠心房组织connexin43主要分布于心肌细胞闰盘处,很少见侧边化分布;而vehicle组大鼠心房组织connexin43出现较多侧边化分布,在心肌细胞闰盘处的分布减少,阻断TRPV4,则可部分恢复connexin43在闰盘处的分布。结论:TRPV4参与无菌性心包炎模型大鼠心房电重构,阻断TRPV4可有效改善无菌性心包炎大鼠心房电重构。TRPV4可能通过调节心房caveolin-3表达及connexin43的分布参与心房电重构。