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本文对从广东省不同养殖场分离的大肠杆菌进行多重耐药性调查，系统进行了大肠杆菌外排泵机制的研究，并筛选20株多重耐药大肠杆菌，结合其他耐药机制如膜孔蛋白缺失及耐氟喹诺酮类基因突变等，探讨在临床大肠杆菌多重耐药性的形成与发展过程中外排泵机制与其他耐药机制之间的相互作用。
1.广东省养殖场大肠杆菌耐药性的调查2003年3月～2005年10月从广州、从化、博罗、高明、江门、花都、阳江、新会、台山、南海、深圳、三水、清远、番禺、顺德、揭西、东莞等23个县、市的58个养殖场分离和鉴定了592株大肠杆菌，其中包括来源于健康和病死的猪、鸡、鸭、鹅和鹧鸪等动物，还包括来源于部分养殖场的水源、土壤等的大肠杆菌，并对分离菌进行了9类31种药物的敏感性测定。结果表明大肠杆菌对氨苄西林、利福平、多西环素和四环素的耐药性严重最严重，耐药率分别为99.5％、99.5％、95.6％和93.4％；其次是对复方磺胺甲嗯唑和阿莫西林，耐药率分别为74.3％和65.0％；敏感性最好的是黏菌素B，耐药率仅为0.5％，其次是头孢曲松(2.41％)；临床分离的大肠杆菌对新霉素、呋喃唑酮、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢拉定较敏感，耐药率都在10％以下；所有菌株对氟喹诺酮类药物呈不同程度耐药，耐药率在30％～60％之间；所有菌株对氨基糖苷类不同药物的耐药性存在很大差异：对链霉素、卡那霉素和庆大霉素的耐药率较高，分别为54.7％、40.7％、36.5％，对新霉素的耐药率仅为7.9％。592株大肠杆菌共有356种耐药谱，种类多而复杂。所分离的592株菌中，4耐的大肠杆菌菌株数最多，有75株，占12.7％；耐药谱型是18耐最多，共有25种耐药谱，占耐药谱种类的7.0％。多重耐药主要集中在15耐至23耐之间，菌株数为216株，占36.5％。在所分离鉴定的592株大肠杆菌中，同时对阿莫西林、四环素、氯霉素、恩诺沙星、卡那霉素均耐药的有171株，占28.9％，表明多重耐药现象的严重。猪源大肠杆菌的耐药性耐药性显著高于禽源大肠杆菌，来源于患病动物(场)的大肠杆菌的耐药性显著高于健康动物(场)。
2.大肠杆菌外排泵基因acrgAB序列研究及acrA、acrB基因的原核表达根据GenBank中大肠杆菌acrR、acrA和acrB基因序列设计3对引物，分别对上述三个基因进行扩增，获得了长度分别为648 bp、1194 bp和3150 bp的基因片段。对不同来源的大肠杆菌的acrRAB基因进行了测序，结果未发现有acrRAB基因缺失株。分析不同来源、不同耐药谱菌株的acrRAB基因序列，结果表明acrR基因碱基和氨基酸的改变与耐药程度没有明显的正相关，而acrA和acrB基因序列随耐药程度增加变化增多，碱基改变导致基酸发生突变。不同来源大肠杆菌的acrR、acrA和acrB基因的同源性分别是98.1％～100％、99.5％～99.9％及94.3％～95.4％。
根据GenBank中的大肠杆菌acrA和acrB基因的碱基序列设计两对引物，扩增了两个基因的片段，分别含有抗原位点和功能区。acrA包含567bp，编码189个氨基酸，acrB包含516 bp，编码172个氨基酸。分别将acrA和acrB基因克隆至大肠杆菌表达系统pET41(+)，获得重组质粒 pET/AcrA和pET/AcrB，两种重组质粒在IPTG的诱导下在大肠杆菌BL21(DE3)中进行融合表达。表达产物进行SDS-PAGE检测，结果显示，AcrA和AcrB融合蛋白的大小分别为22 KD、20 KD，与预期的结果相一致，并且两种融合蛋白均呈可溶性表达。大量诱导表达两种融合蛋白后，取融合蛋白的上清用50％Ni-NTA树脂过柱纯化，将洗涤部分进行SDS-PAGE检测，表明用此纯化方法能得到高纯度蛋白。采用纯化蛋白间隔三周到四周免疫兔分别获得抗AcrA和AcrB抗体。采用双抗体夹心法，分别用AcrA、AcrB抗体包被酶标板，建立外排泵表达水平的ELISA检测法。
3.大肠杆菌分离株多重耐药机制的探讨从广东省养殖场不同动物及环境中分离的大肠杆菌中筛选20株多重耐药大肠杆菌，从主动外排泵的表达水平、外排泵抑制剂和能量抑制剂对细菌多重耐药性的影响、耐药质粒的获得、膜孔蛋白缺失及耐氟喹诺酮类基因突变等几个方面探讨临床分离多重耐药大肠杆菌的耐药机制，以及几种耐药机制对多重耐药性表型、耐药水平的贡献。结果表明，筛选的20株临床分离多重耐药菌普遍存在外排泵的作用机制，主要介导对庆大霉素、新霉素、四环素、氯霉素、氟苯尼考、氟喹诺酮类药物和利福平的耐药，当存在能量抑制剂CCCP或外排泵抑制剂PAβN时，能使大部分耐药菌株对些药物的MIC值下降，但除利福平外，对大多数药物的敏感性没有完全恢复。实验室条件下用各类不同药物诱导的多重耐药株，在添加CCCP或PAβN后，各类药物MIC值的改变趋势与临床分离耐药菌的相似，这说明广东省临床分离的大肠杆菌多重耐药性与外膜上存在的外排泵机制有关，但也存在其他耐药机制的协同作用。用制备的AcrA、AcrB抗体检测临床分离和体外诱导的大肠杆菌多重耐药菌株，结果表明，所有被测菌株外排泵表达水平明显增高；临床分离的大肠杆菌多重耐药株ER01、ER03、ER09、ER12、ER17、ER18等均缺失OmpF蛋白，ER01、ER03、ER04、ER05、ER12、ER13、ER15、ER19缺失OmpC蛋白，其中ER01、ER03、ER04同时缺失OmpC、OmpF蛋白。还发现一些临床分离多重耐药大肠杆菌(如ER01、ER02、ER05、ER06、ER08、ER09、ER12等)在邻近OmpC处出现一条蛋白带Mrp(多重耐药相关蛋白)；筛选的20株临床分离多重耐药大肠杆菌发生了与FQs耐药有关的gyrA83、gyrA87、parC80共同突变，突变率为50％(10/20)，但是仅从gyrA和parC基因的突变的方面还不能完全解释本研究从广东省分离的这些多重耐药菌对FQs的高水平耐药，但是这两个基因的突变协助了临床分离株对FQs药物高水平耐药性的获得，是基因突变和外排泵机制共同作用的结果，导致了临床分离大肠杆菌对FQs的高水平耐药。广东省临床分离大肠杆菌多重耐药性的获得存在多种耐药机制，但外排泵表达水平的增高是主要原因，同时伴有外膜膜孔蛋白缺失和相关基因突变等机制的协同作用。