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猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是严重危害我国养猪业的重要病原之一。目前对PCV2的防控以疫苗免疫为主,市场上商品化PCV2疫苗有很多,其中大多数疫苗需要添加佐剂来提高免疫效应,传统佐剂因其具有强大的免疫功效得到广泛的应用,但同时也会引起一些毒副反应,对机体产生潜在的健康风险。近来,有研究显示APCH1（Antigen presenting cells homing 1）重组单链抗体可以携带抗原靶向至抗原呈递细胞（APCs）,并与主要组织相容性复合体II类分子（MHCII）的抗原位点结合,形成抗原肽-MHCII分子复合物,然后转运至APCs表面供T淋巴细胞受体（TCR）识别,从而显著增强亚单位疫苗的免疫效果。鉴于此,本研究利用杆状病毒表达载体系统,将APCH1与PCV2 Cap蛋白进行融合表达,构建了具有分子佐剂活性的PCV2亚单位基因工程疫苗,并在动物体内对所构建的疫苗进行了免疫效力评价。主要研究内容如下:1.重组杆状病毒rBV-APCH1-Cap的构建及体外表达人工合成重组单链抗体APCH1基因以及昆虫细胞密码子优化的PCV2 ORF2基因（编码Cap蛋白）,以此为模板,通过PCR扩增得到APCH1基因以及去除核定位序列的ORF2基因（△41ORF2）,分别通过酶切、连接,构建双拷贝、融合表达APCH1-△41ORF2基因的重组转移质粒pFastBac Dual-D-ACPH1-△41ORF2。随后将该重组转移质粒转化DH10Bac大肠杆菌,通过蓝白斑筛选阳性克隆,提取重组rBacmid-APCH1-△41ORF2基因组,利用PCR证实APCH1-△41ORF2基因已经整合到重组杆状病毒Bacmid中。将Bacmid转染Sf9昆虫细胞,获得了重组杆状病毒rBV-APCH1-Cap。间接免疫荧光和Western blot实验证实,该重组杆状病毒能在昆虫细胞中高效表达APCH1-Cap重组蛋白。2.猪圆环病毒2型Cap蛋白双抗夹心ELISA定量检测方法的建立为了方便快捷地检测重组杆状病毒表达的PCV2 Cap蛋白含量,构建了分泌表达PCV2 Cap蛋白的重组杆状病毒rBV-Cap-His,将表达的蛋白经镍柱纯化后获得浓度为0.37 mg/mL的纯化蛋白。以此纯化蛋白免疫小鼠获得两株针对PCV2 Cap蛋白的特异性单克隆抗体2D3,3E10。将单抗2D3和3E10分别作为包被抗体和检测抗体,以纯化的蛋白为抗原,建立了检测PCV2 Cap蛋白含量的双抗夹心ELISA方法,并根据不同含量Cap蛋白的OD630值绘制了标准曲线。用建立的ELISA方法和Western blot同时对3份纯化的Cap蛋白样品进行平行检测,根据标准曲线和ImageJ灰度分析分别确定两种方法所检测的蛋白的含量。结果显示两种检测方法获得的蛋白含量具有良好的相关性,证实所建立的双抗夹心ELISA方法是可靠的,可以用于PCV2 Cap蛋白的定量。3.重组亚单位疫苗APCH1-Cap在小鼠体内诱发的保护性免疫为了评估APCH1的分子佐剂效应,本研究比较了分子佐剂亚单位疫苗APCH1-Cap与常规亚单位疫苗Cap蛋白的免疫原性的差异,分别以2μg/只、20μg/只的剂量免疫BALB/c小鼠,结果表明APCH1-Cap诱导的ELISA抗体水平以及IFN-γ、IL-4表达量均显著高于Cap蛋白免疫组,且免疫反应与接种剂量呈正相关。攻毒实验进一步表明,分子佐剂亚单位疫苗APCH1-Cap在小鼠体内诱导的中和抗体显著高于常规亚单位疫苗Cap蛋白免疫组。组织病理学结果表明,攻毒对照组小鼠脾小结和淋巴小节中有少量淋巴细胞坏死,脾巨噬细胞可见,分子佐剂亚单位疫苗APCH1-Cap免疫组小鼠组织结构完整,未见明显粒细胞浸润。这些结果表明分子佐剂APCH1有助于增强Cap蛋白诱导的体液免疫反应和细胞免疫反应。综上所述,与常规亚单位疫苗Cap蛋白相比,分子佐剂亚单位疫苗APCH1-Cap可以通过APCH1的靶向作用,增强抗原呈递细胞的抗原加工处理与呈递作用,有效激发小鼠产生更强的体液免疫和细胞免疫应答,进而发挥更有效的免疫保护。本研究将为新型高效的猪圆环病毒疫苗研究奠定良好的实验基础,此外,靶向MHCII分子的疫苗设计策略也将为其他病原微生物疫苗研究提供借鉴。