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背景:原发性肝癌（Primary Liver Carcinoma,PLC）是我国常见的恶性肿瘤之一,其发病率在所有恶性肿瘤中排名第4,但死亡率很高,排名第2位,其中肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）的发病率约占PLC的75-85%。尽管肝癌的诊疗技术不断提高,但由于肝癌发病因素复杂、易转移、对化疗不敏感、手术切除后易复发,PLC患者的总体生存率仍不高。如何降低PLC的死亡率是本领域研究的热点之一,且迄今为止肝癌发生、发展的分子机制尚未完全阐明。因此,深入研究肝癌发生发展的分子机制,寻找新的潜在治疗靶点,具有重要的现实意义。细胞色素P450氧化酶（Cytochrome P4502E1,CYP2E1）是重要的肝脏代谢酶之一,主要参与药物、前致癌物及环境毒物的代谢。研究表明随着PLC的进展癌组织中的CYP2E1表达水平逐渐下降,且CYP2E1低表达与肝癌的恶性生物学特征及患者生存期缩短密切相关,但是CYP2E1在肝癌恶性生物学行为进展过程中的具体作用及机制尚不明确。目的:1.通过检测肝癌组织及不同肝癌细胞株中的CYP2E1表达水平,评估CYP2E1表达水平与HCC病人预后的相关性;2.采用体内、外实验方法研究CYP2E1对肝癌SK-Hep1和HCC-LM3细胞株的增殖、迁移和侵袭的影响;3.探讨CYP2E1在HCC发生、发展中的作用机制,为今后肝癌患者的防治提供新的治疗靶点及实验依据。方法:第一部分:CYP2E1在肝癌细胞株及肝癌组织标本中表达的意义1)从TCGA（Cancer Genome Atlas）数据库下载HCC数据进行生物信息学分析,探讨CYP2E1在HCC发生、发展及预后中的临床意义;2)培养正常肝细胞株 L02,肝癌 SK-Hep1、HepG2、HCC-LM3 和 SMMC-7721细胞株至对数生长期稳定后采用RT-PCR法检测各细胞株中CYP2E1的表达;3)收集44例术后肝癌及癌旁组织,采用H-E染色和免疫组化（immuno-histochemistry,IHC）染色方法观察肝癌组织的病理形态及CYP2E1在肝癌及癌旁组织中的表达。第二部分:CYP2E1在肝癌SK-Hep1和HCC-LM3细胞株中表达的意义1)构建慢病毒介导的CYP2E1过表达肝癌细胞株;2)利用CCK-8、平板克隆形成及Edu实验等方法检测两组肝癌SK-Hep1和HCC-LM3细胞株的增殖率;3)运用划痕实验和Transwell实验方法检测SK-Hep1和HCC-LM3两组细胞的迁移和侵袭功能的变化;4)采用流式细胞术检测SK-Hep1和HCC-LM3两组肝癌细胞株的细胞周期;5)利用Western Blotting法检测SK-Hep1和HCC-LM3两组肝癌细胞株周期相关蛋白和细胞增殖抗原;6)构建裸鼠皮下成瘤及肺转移模型,观察CYP2E1对SK-Hep1和HCC-LM3两组肝癌细胞在体内成瘤的抑制作用及转移的影响;7)采用IHC染色方法观察SK-Hep1和HCC-LM3两组肝癌细胞的裸鼠皮下成瘤组织中Ki-67的表达。第三部分:探讨CYP2E1对肝癌细胞增殖、侵袭和迁移可能的分子机制1)采用TCGA数据库挖掘数据分析肝癌及癌旁组织中HDAC6mRNA表达水平及CYP2E1和HDAC6在TCGA肝癌组织中mRNA表达的差异;利用基因转录组测序方法观察CYP2E1在SK-Hep1肝癌细胞株中过表达后的相关靶分子HDAC6的表达;2)CYP2E1在SK-Hep1和HCC-LM3肝癌细胞株中过表达后,检测两种肝癌细胞株中HDAC6、MAPK、PI3K及AKT信号通路蛋白和HDAC6磷酸化水平,并分析CYP2E1对HDAC6的调控机制;3)利用RNA干扰技术沉默SK-Hep1和HCC-LM3肝癌细胞株中过表达的CYP2E1基因,采用Western blotting检测两种肝癌细胞株中HDAC6及MAPK和PI3K-AKT/HDAC6信号通路蛋白磷酸化水平;4)对过表达CYP2E1的SK-Hep1和HCC-LM3肝癌细胞株给予Tubastatin A抑制HDAC6活性,利用Edu试剂盒检测两组肝癌细胞的增殖能力。5)利用IHC染色法观察肝癌及癌旁组织中p-HDAC6蛋白水平。结果:第一部分:1)TCGA数据库的数据分析显示CYP2E1在肝癌中表达低于癌旁组织,两组之间具有统计学差异[中位数为-2.606（-3.677—-1.673）,P＜0.001];Kaplan-meier生存分析结果CYP2E1低表达患者的总生存期明显短于过表达患者（P=0.03）;2)与正常 LO2 肝细胞株相比,SK-Hep1、HepG2、HCC-LM3 和 SMMC-7721中CYP2E1表达下调,其中SK-Hep1和HCC-LM3细胞株中表达最低P＜0.01);3)IHC染色结果CYP2E1在肝癌组织中的表达低于癌旁组织。第二部分:1)CCK-8实验、平板克隆形成实验及Edu实验结果显示,与对照组比较,过表达CYP2E1的肝癌SK-Hep1及HCC-LM3细胞株其细胞增殖能力明显下降;2)细胞划痕实验及Transwell迁移实验结果均证实CYP2E1过表达的肝癌SK-Hep1和HCC-LM3肝癌细胞株的迁移明显受到抑制;3)流式细胞术检测结果CYP2E1过表达的SK-Hep1和HCC-LM3细胞均在G1 期阻滞;Western Blotting 结果显示过表达 CYP2E1 的 SK-Hep1 和 HCC-LM3细胞株中Cyclin D1、CD4、CD6及Ki-67的蛋白表达水平明显降低;4)裸鼠皮下成瘤结果显示高表达CYP2E1的SK-Hep1和HCC-LM3细胞株的成瘤体积明显小于低表达组;5)H-E染色观察裸鼠尾静脉注射肝癌细胞肺转移模型的结果,低表达组肺组织中形成明显的肝癌细胞肺转移灶,而过表达CYP2E1组无肝癌肺转移灶;6)IHC染色结果,与低表达CYP2E1组比较,高表达组皮下成瘤组织中K-i67表达明显降低。第三部分:1)TCGA数据库的分析结果显示:HDAC6在肝癌组织中的表达低于癌旁组织,两组比较具有统计学差异（t=-7.916,P＜0.001）;利用转录组测序和生物信息学方法分析结果表明HDAC6在CYP2E1调控肝癌进展过程中发挥协同作用;2)Western blotting法检测结果,过表达CYP2E1的肝癌细胞株中p-HDAC6蛋白水平增高,而p-MEK1/2、p-p38MAPK、p-PI3K及p-AKT蛋白水平显著降低（P＜0.001）;3)沉默CYP2E1的肝癌细胞株中HDAC6磷酸化水平降低,但MAPK/PI3K-AKT通路蛋白的磷酸化水平增高;4)Edu检测结果表明对过表达CYP2E1的肝癌细胞株给与HDAC6抑制剂后肝癌细胞株的增殖能力显著增高;5)IHC染色结果p-HDAC6在肝癌组织中表达降低,而在癌旁组织中表达升高。结论:1.CYP2E1蛋白在肝癌组织中表达与患者的生存时间呈正相关,它可能成为评价HCC患者预后的指标之一。2.过表达的CYP2E1可抑制肝癌的增殖和转移,可能成为治疗肝癌、改善预后的靶点之一。3.CYP2E1可通过抑制MAPK和PI3K/AKT通路促进HDAC6的磷酸化,抑制肝癌细胞的增殖和转移。