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目的:本文以模拟天然软骨发育过程中间充质凝聚阶段为目的,探究软骨发育过程中细胞间作用(cell-cell)和细胞-微环境相互作用(cell-ECM)对MSC成软骨分化的影响。首先,通过体外细胞微球的构建达到只有cell-cell相互作用的目的;然后,又建立了胶原水凝胶包裹细胞微球体系,为细胞微球提供了良好的生物微环境;最后,通过PLL促进N-cadherin基因CDH2表达的作用,进一步探究细胞间作用(cell-cell)和细胞-微环境相互作用(cell-ECM)对软骨发育的协同作用。方法和结果:第一部分,我们通过免疫荧光筛选出1ml浓度为50μg/ml的anti-N-cadherin可以封闭4×10~6个间充质干细胞。然后,又通过384孔悬滴板成功制备了细胞微球(MSC microspheres,MMs)。实验分为两组:细胞微球加封闭抗体组(MMA+),细胞微球不加封闭抗体组(MMA-)。经过两周的体外培养并分别在1D、3D、7D、14D时取样,FDA/PI染色证明两组细胞活性良好;定量检测了DNA、GAG的表达量,得出两组间DNA表达量差异不大,但GAG/DNA表达量MMA-组要高于MMA+组。然后,通过细胞骨架鬼笔环肽染色,我们发现MMA-组肌动蛋白微丝变短、致密化的时间要明显快于MMA+组。接着,通过组织学染色和免疫组化染色,我们发现在软骨陷窝形态出现和软骨特异性基质分泌时间上,MMA+组都明显落后于MMA-组。最后,RT-PCR技术检测软骨相关基因的表达,发现在基因的表达上MMA-组也是高于MMA+组。第二部分,利用硅胶模具制备了胶原水凝胶包裹细胞微球(collagen hydrogel-encapsulated MMs,CMMs)。对胶原包裹细胞微球加抗体(CMMA+)和胶原包裹细胞微球不加抗体(CMMA-)两组进行四周的体外培养并分别在1D、3D、7D、14D、28D时取样。通过细胞骨架染色发现,随着培养时间延长,CMMA-组肌动蛋白微丝聚集和致密化的速度要早于CMMA+组。通过组织学和免疫组织学染色,我们看到了在CMMA-组出现的分化后软骨细胞“迁移”现象和CMMA+组分泌软骨特异性基质早于MMA+组,说明胶原不仅可以改善N-cadherin封闭抗体带来的影响,而且有助于正常干细胞分化为软骨细胞后的迁移。然后,又通过琼脂糖水凝胶包裹细胞微球作为对照,发现在琼脂糖中并没有软骨细胞“迁移”发生,进一步证明了这种“迁移”现象是胶原特异性引起的。通过基因表达分析,发现在CMMA-组软骨相关基因也高于CMMA+组。第三部分,通过细胞毒性实验和RT-PCR技术筛选出多聚赖氨酸(poly(L-lysine),PLL)浓度为5μg/ml时有最好的促进CDH2基因表达作用。然后,将PLL用于MMs体外培养培养,通过组织学染色和RT-PCR技术,证明PLL在促进CDH2表达时确实也加快了软骨特异性基质分泌和软骨相关基因的表达。然后,又将PLL用于CMMs体系的培养,发现在PLL促进CDH2表达和胶原外基质微环境的共同作用下,不仅加快了MSC的成软骨分化时间而且也更加明显地促进了软骨细胞的“迁移”。最后,在无诱导因子TGF-β1存在情况下,PLL和胶原微环境的协同作用可以诱导CMMs体系中MSC分化为软骨细胞。结论:通过此次实验,我们得出了如下结论:一、在细胞微球(MMs)体系模拟间充质凝集阶段中,N-cadherin蛋白对MSC成软骨分化的启动起着至关重要的作用。二、胶原微环境可以改善N-cadherin功能屏蔽后对MSC成软骨分化造成的影响,并且能特异性地引起分化后的软骨细胞发生“迁移”。三、在多聚赖氨酸(PLL)促进N-cadherin基因CDH2表达后,加快了细胞微球(MMs)软骨特异性基质分泌和软骨相关基因的表达;同时,在无TGF-β1存在时,胶原和PLL也能协同诱导MSC分化为软骨。