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目的 探索钙调蛋白依赖性激酶Ⅱδ(CaMKⅡδ)基因沉默对破骨细胞分化、骨吸收功能的影响以及c-fos、c-jun、CREB基因在CaMKⅡδ调控破骨细胞分化中的作用,以揭示破骨细胞分化调控的分子机制。方法 1、CaMKⅡδRNA干扰效率的测定。构建CaMKⅡδ RNA干扰载体;将小鼠RAW264.7细胞分为空白组、阴性载体组和干扰载体组;后两组细胞分别转染阴性载体病毒和干扰载体病毒;病毒转染12h后,换新鲜完全培养基,加入核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)诱导;5天后收获细胞,提三组细胞的RNA进行Real-time PCR检测CaMKⅡδ的mRNA表达水平,提取三组细胞总蛋白进行Western-blotting检测CaMKⅡδ蛋白水平。2、TRAP染色检测沉默CaMKⅡ δ基因对破骨细胞分化的影响,牛骨吸收陷窝检测沉默CaMKⅡδ对破骨细胞吸收功能的影响。方法是使用慢病毒分别转染阴性载体组、干扰载体组12小时,之后用50ng/ml RANKL诱导5天后收获,并完成上述检测。3、CaMKⅡδ基因沉默对c-fos、c-jun、CREB表达的影响。细胞处理方法同前,RANKL诱导2天后收获。利用Real-time PCR、Western-blot方法检测 c-fos、c-jun、CREB mRNA和蛋白的表达情况。4、CaMKⅡδ基因沉默对c-fos、c-jun、CREB蛋白荧光强度的影响:在培养箱培养于诱导3天收获细胞,进行免疫荧光细胞化学检测。结果 1、经Real-time PCR检测,空白组、阴性载体组和干扰载体组中CaMKⅡδmRNA相对表达水平分别为 1.282±0.234、0.950±0.275和0.377±0.148(P<0.05);空白组与阴性载体组之间无显著性差异(P>0.0δ),而干扰载体组较空白组下降了70.6%(P<0.01),即mRNA干扰效率为70.6%。CaMKⅡδ蛋白相对表达水平经Western-blotting检测后,空白组、阴性载体组和干扰载体组分别与β-actin的比值如下:1.063±0.457、1.006±0.139和0.295±0.032。空白组与阴性载体组之间无显著性差异(P>0.05);而干扰载体组中CaMKⅡδ蛋白水平较空白组下降了 72.2%(P<0.01)即CaMKⅡδ蛋白干扰效率为72.2%。2、细胞诱导5天后观察三组培养的RAW264.7细胞,发现空白组、阴性载体组、干扰载体组的培养瓶内均出现TRAP染色阳性的多核破骨细胞。对比三组多核破骨细胞的数目发现,空白组数量为12.7±2.49、阴性载体组数量为11±1.63、干扰载体组数量为4±1.63。经统计学分析后,结果显示,空白组与阴性载体组数量差异无统计学意义(P>0.05);空白组与干扰载体组数量差异具有统计学意义(P<0.05);阴性载体组与干扰载体组数量差异具有统计学意义(P<0.05)。同时镜下观察三组破骨细胞的体积大小发现,空白组、阴性载体组培养瓶内破骨细胞体积大,而干扰载体组培养瓶内的多核破骨细胞体积也较前两组明显缩小。同时通过扫描电镜观察骨磨片上三组骨吸收陷窝形成情况,结果显示,三组吸收陷窝的数目及面积分别为空白组10±2.65和5694±536.21μm2、阴性载体组 12±1.23和5247±635.24 μm2、干扰载体组3±2.31和2437±143.65μm2。经统计学分析后,空白组与阴性载体组骨吸收陷窝数目及面积的差异无统计学意义(P>0.05);干扰载体组骨吸收陷窝数目及面积较空白组、阴性载体组显著降低(P<0.05)。综上可知,破骨细胞的分化和骨吸收功能在沉默CaMKⅡδ后受到了显著的抑制。3、CaMKⅡδ基因沉默可显著降低c-fos、c-jun、CREB的mRNA水平,下调幅度分别为74%、49%和24%;CaMKⅡδ基因沉默可显著降低c-fos、c-jun、CREB的蛋白水平,下调幅度分别为74.3%、61.3%和59.2%。4、免疫荧光细胞化学检测空白组、阴性载体组、干扰载体组的表达荧光强度,结果显示前两组c-fos、c-jun、CREB蛋白表达呈强阳性,主要分布在胞浆,胞核也有表达;而干扰载体组中c-fos、c-jun、CREB蛋白表达较弱,主要分布在胞浆,胞核中未见表达。上述结果提示,CaMKⅡδ沉默不仅抑制上述三个基因的蛋白表达,而且抑制了上述蛋白的基因调控功能。结论 1、CaMKⅡδ基因沉默可以显著抑制破骨细胞分化以及骨吸收功能。2、CaMKⅡδ基因沉默可显著抑制c-fos、c-jun、CREB的mRNA和蛋白水平表达;提示三者参与了CaMKⅡδ对破骨细胞分化的调控。图9幅;表4个;参129篇。