论文部分内容阅读
目的:乳腺癌是世界上女性最常见的恶性肿瘤。临床上,肿瘤病人的死亡90%是由于肿瘤的复发转移引起的。因此,探究乳腺癌发生、发展、浸润及转移的分子生物学机制是现今的研究热点。TET1是近年来发现的促进DNA去甲基化过程的重要蛋白,可通过催化5-甲基胞嘧啶(5m C)进一步转化为5-羟甲基胞嘧啶(5hm C)参与DNA去甲基化和基因表达的调控。已有一些研究证实,在人类实体肿瘤中TET基因突变与5hm C水平的改变与肿瘤的发生、发展、预后有着显著相关性,但其具体作用机制众说不一。为此,本研究首先通过检测乳腺癌组织及良性乳腺病变组织中TET1的表达情况,探究TET1与乳腺癌临床病理特点之间的关系;随后测定了TET1在不同乳腺癌细胞系中的表达情况;最后通过建立高表达TET1的MCF-7细胞株,研究TET1对MCF-7细胞增殖、细胞周期及迁移能力的影响,并初步探究其相关分子机制,以期为临床治疗肿瘤提供新的靶点。方法:1随机收集2012年1月至2014年6月河北医科大学第四医院乳腺中心收治的原发性乳腺癌患者62例,并收集乳腺良性病变患者10例作为对照组。随后于我院病理科采用免疫组化Max Vision TM一步法检测所有患者术后病理组织的TET1表达,结合患者年龄、术后的肿瘤大小、淋巴结状态、病理学分期、组织学分级、是否有脉管瘤栓、分子分型及ER、PR、HER-2、P53及Ki-67的表达情况,探讨TET1的表达与乳腺癌临床病理特点的关系。2应用PCR及Western blot检测SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453四种乳腺癌细胞系中TET1的表达情况,并以非肿瘤源性肾上皮细胞HEK293及脐带间充质干细胞(hmsc)作为对照进行比较分析。3应用质粒转染方法,建立TET1高表达稳转细胞株(MCF-7-TET1)及携带e GFP的阴性对照组稳转细胞株(MCF-7-vector),CYBRGreen法实时定量PCR检测TET1在转录水平的表达状况。4倒置显微镜下观察转染细胞的形态,以MCF-7-vector作为阴性对照,以MCF-7作为空白对照,应用CCK-8法检测高表达TET1对MCF-7细胞增殖的影响,应用流式细胞学技术检测TET1对细胞周期的影响,利用细胞划痕实验检测TET1对细胞迁移能力的作用,并应用q PCR检测EMT相关基因(CDH1、VIM、TGFB1、CTNNB1)在转录水平的表达。5应用SPSS19.0统计进行数据分析,免疫组化结果采用卡方检验及Spearman相关性检验。两独立样本的比较应用成组t检验分析,多组间均数比较应用单因素方差分析,多样本均数间多重比较应用Tukey检验,数据用mean±SD表示,每组实验不少于3个独立样本的重复,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1在62例原发性乳腺癌标本中,TET1低表达者共33例,高表达者共29例,原发性乳腺癌中的TET1低表达率为53.23%;在10例乳腺良性病变标本中TET1低表达者0例,高表达者共10例,乳腺良性病变的TET1低表达率为0%。TET1在原发性乳腺癌组织及乳腺良性病变中的表达差异有统计学意义,χ2=7.799,P=0.005。2根据肿瘤大小,将62例原发性乳腺癌患者分为≤2cm组,共32例,>2cm组,共30例,TET1在两组间的表达差异有统计学意义,χ2=3.218,P=0.040。3根据淋巴结转移个数,将62例患者分为无淋巴结转移组,共29例;有淋巴结转移组,共33例。TET1在两组间的表达差异有统计学意义,χ2=5.120,P=0.024。4根据病理学分期,将62例患者分为0~Ⅰ期组,共19例;Ⅱ期组,共23例;Ⅲ期组,共20例。三组间TET1的表达差异有统计学意义,χ2=11.480,P=0.003。采用Spearman进行相关性分析后发现,TET1的表达水平与病理学分期成负相关,相关系数r=-0343,P=0.006。5根据组织学分级,将62例患者分为Ⅱ级组,共36例;Ⅲ级组,共20例;不能判定者6例。两组间TET1的表达差异有统计学意义,χ2=4.134,P=0.042。6根据术后病理中的脉管瘤栓情况,将62例患者分为有脉管瘤栓组,共35例;无脉管瘤栓组,共26例;无法判定者1例。两组间TET1的表达差异有统计学意义,χ2=9.932,P=0.002。7 TET1在不同分子分型乳腺癌中的表达无明显差异,TET1的表达与患者年龄及Ki-67、HER-2、ER、PR、P53的表达无关(P>0.05)。8 RT-PCR测定HEK-293、SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453、hmsc六种细胞的TET1 m RNA的相对表达量分别为0.399±0.007,0.073±0.005,0.103±0.002,0.088±0.003,0.111±0.003,0.025±0.001;q PCR测定以上六种细胞中TET1 m RNA的相对表达量分别为1.070±0.250,0.260±0.150,0.160±0.100,0.060±0.020,0.190±0.220,0.080±0.050,HEK-293细胞系中的TET1 m RNA表达量与其余细胞进行比较,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot法测定六种细胞中TET1蛋白的相对表达量分别为1.252±0.016,0.773±0.008,0.789±0.029,0.860±0.061,0.672±0.002,1.711±0.093。将HEK-293及hmsc细胞中的TET1蛋白表达量与其余细胞进行比较,差异有统计学意义(P<0.05)9成功建立高表达TET1的MCF-7细胞模型,收集MCF-7、MCF-7-vector应用流式细胞学技术检测荧光细胞数及荧光强度,两者的荧光细胞数(%)分别为:3.067±0.006和97.557±0.090;荧光强度分别为:11.873±0.111和3320.353±41.787,MCF-7-vector细胞荧光细胞数及荧光强度显著增加,有统计学意义(P<0.05)。CYBRGreen法q PCR检测TET1 m RNA表达,结果显示,与空白对照组MCF-7相比,MCF-7-TET1细胞中TET1上调203.75±25.67倍;与阴性对照组MCF-7-vector相比,MCF-7-TET1细胞中TET1上调70.09±38.47倍,差异均有统计学意义(P<0.05)。10 CCK-8法检测细胞增殖能力,空白对照(MCF-7)及阴性对照组(MCF-7-vector)细胞增殖未见明显差异(P>0.05),而MCF-7-TET1细胞增殖能力明显减低,差异有统计学意义(P<0.01)。11流式细胞学技术检测细胞周期结果显示,在培养72h后,空白对照及阴性对照组各细胞周期间无显著差异(P>0.05),而与两组对照组细胞相比,MCF-7-TET1组细胞虽sub-G0期未见明显变化,但G0/G1期比例明显增加:空白对照及阴性对照组细胞G0/G1期分别占45.57±2.23%、45.29±0.71%,而MCF-7-TET1细胞G0/G1期占57.96±0.74%;同时伴有S期及G2/M期比例明显减低,差异均有统计学意义(P<0.05)。12细胞划痕实验检测肿瘤细胞迁移能力,与空白对照(MCF-7)及阴性对照组(MCF-7-vector)相比,MCF-7-TET1细胞迁移能力显著下降,差异有统计学意义(P<0.01)。13 q PCR检测各组细胞中EMT相关基因的表达,其中CDH1及CTNNB1表达增加,差异有统计学意义(P<0.01),而VIM及TGFB1表达无统计学差异(P>0.05)。结论:1 TET1在原发性乳腺癌组织中的表达较良性乳腺病变组织明显降低;TET1低表达于肿瘤>2cm、伴有淋巴结转移、病理学分期较晚、高组织学分级及有脉管瘤栓有关,可协助判断病情。2相较于非肿瘤源性上皮细胞,TET1在乳腺癌细胞中表达明显降低。3成功构建稳定表达TET1的MCF-7-TET1细胞株及相应对照细胞株MCF-7-vector。4 TET1通过诱导细胞周期G0/G1期阻滞抑制MCF-7乳腺癌细胞增殖。5 TET1抑制MCF-7细胞迁移,其机制可能与通过Wnt/β-catenin通路抑制EMT的发生相关。