肾综合征出血热（HFRS）是一种由汉坦病毒属病毒引起，临床上主要表现为发热、出血和肾功能损害的急性病毒性传染病。该病是我国死亡人数最多的急性病毒性传染病之一，年发病人数为5-10万人，临床病情严重，病死率较高。目前尚缺乏特异有效的预防和治疗方法。 汉坦病毒属布尼亚病毒科，是一种有囊膜的单股负链RNA病毒，基因组分为大（L）、中（M）、小（S）3个节段，分别编码病毒的RNA依赖的RNA聚合酶、囊膜糖蛋白（G1和G2）以及核蛋白（NP）。研究表明，汉坦病毒的M基因编码的囊膜糖蛋白（GP）可刺激机体产生中和抗体，而对感染动物和人体起到保护作用，且GP的中和抗原位点主要位于G2上。但GP免疫原性较弱，刺激产生的抗体出现晚，滴度不高。 本室前期研究结果表明，汉坦病毒S基因编码的NP抗原位点主要集 第四军医大学博士学位论文 一 中在8基因编码区5’端约0．7＊b片段的编码蛋白上。另外，NP八泊病》：Z 结构蛋白中免疫原性最强，其刺激机体产生的特异性抗体出现早、涧度高、 维持时间长。国内外研究结果均证实NP不仅具有很强的兔疫原性，而且 它也具有诱导免疫保护，包括诱导机休细胞免疫应答的作用。因此，汉坦 病毒GP和NP在诱导机体免疫应答中可能均起重要作用，如何发挥不同 结构蛋白在诱导机体免疫应答中的优势互补作用，是汉坦病毒基因工程疫 菌研究中亟待解决的问题。 本实验将编码HTNV GZ的M基因片段与编码NP氨基端aal274的 S基因片段进行了融合表达，以期达到不同结构蛋白在诱导机体免疫应答 中的优势互补。首先，我们构建了嵌合片段的原核表达载体pGEX4Tl －GZSO．7与pGEX＊T1．7G2，诱导表达了相应的融合蛋白GST－G。NO．7、 GST－NO．7G2，并采用 SDS－PAGE、WestCS－blot及ELISA方法对表达产物 进行鉴定。SDS．PAGE未能观察到融合蛋白的表达带：Western－hi血结果 表明，嵌合基因在原核表达系统中表达了分子大小正确的融合蛋白，且该 融合蛋白与抗HINV NP特异性mAb有一定的结合活性：ELISA结果表 明，嵌合基因表达的融合蛋白不仅与抗HThV NP特异性mAb有较高的 结合活性，与抗HINV GP特异性mAb也有较弱的结合活性，证明该融合 蛋白保持了亲本蛋白各自的活性。 在原核表达嵌合基因的基础上，我们又构建了嵌合基因及其亲本基因 的真核表达载体pCDNA3．IGZSO．7、pCDNA3．ISO．7G2、pCDNA3．IG2以及 pCDNA3．1S．7，并进一步研究了各重组真核表达载体在哺乳动物细胞中 的表达以及基因免疫对诱导小鼠产生体液及细胞免疫应答的能力。同时我 们还比较了不同佐剂对基因免疫效果的影响。用脂质体法转染COS－7细 胞，用RTPCR、间接免疫荧光法及免疫共沉淀检测表达结果，结果表明 各重组质粒在哺乳动物细胞中可以表达相应的目的蛋白，且嵌合基因表达 吕 第四军医大学博士学位论文 一 的的确为融合蛋白。用重组真核淡达8划木见疫BALB儿小鼠，并川ELSA 法检测免疫鼠血清特异性抗体，用细胞微显培养中和试验检测鼠免疫血消 中的中和抗体，用淋巴细胞增殖试验检测免疫鼠的细胞免疫应答效果。 ELISA检测结果表明，嵌合基因可同时诱导产生抗HTNV NP及GZ糖蛋 白的特异性抗体，且pCDNA3．IGZSO．7组的抗NP特异性抗体的效价与 pCDNA3．ISO．7组相当，其抗GP特异性的抗体效价比pCDNA3．IGZ组要 高：而pCDNA3．ISO．7G2组与pCDNA3．ISO．7组及pCDNA3．IGZ组相比， 其抗体效价明显低于这两组；各组用佐剂免疫的小鼠，加空载体佐剂组刺 激机体产生抗体的水平明显高于IL－2组与不加佐剂组。微量细胞培养中和 试验检测结果表明，各免疫组小鼠均产生了不同滴度的中和抗体，但中和 抗体效价较低。淋巴细胞增殖试验表明，嵌合基因免疫小鼠的脾细胞对 NP及GP的增殖指数均明显高于空载体对照组；pCDNA3．IGZSO．7组增 殖指数比eDNA3．IS0．7组高，与pcDNA3．IGZ组相近：但pcDNA3．l －SO．7G2组未检测到其淋巴细胞有明显的增殖。淋巴细胞增殖试验结果还 表明各组用佐剂免疫的小鼠，加空载体佐剂组刺激机体产生特异性细胞免 疫的水平明显高于IL－2组与不加佐剂组。 以上实验结果表明，HWIV M基