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目的结核杆菌属胞内寄生菌，比较基因组学对卡介苗和H37RV进行对比，发现所有卡介苗缺失RD1区。研究发现RD1区存在于所有的致病性结核分枝杆菌，而结核杆菌毒力的强弱与细胞的凋亡成负相关。有假说认为RD1区的分泌蛋白ESAT6和CFP10与细胞的凋亡有关。卡介苗是目前唯一应用的结核病疫苗，但是卡介苗对成人的保护效果低。本试验对分泌蛋白ESAT6、CFP10与细胞的凋亡关系进行研究，并用构建的ESAT6和CFP10真核表达载体分别与卡介苗一起免疫小鼠，检测抗体和IFN-y的变化，为开发新的疫苗提供数据参考。方法：⑴设计ESAT6、CFP10基因的引物，以灭活的结核杆菌H37Rv为模板，用PCR方法扩增得到ESAT6、CFP10基因全长。（2)将ESAT6、CFP10基因与T载体连接，构建克隆载体pGM18-T-ESAT6、pGM18-T-CFP10；双酶切克隆载体pGM18-T-ESAT6、pGM18-T-CFP10后，将ESAT6、CFP10基因分别与pEGFP-Nl真核表达载体连接，构建重组真核表达载体pEGFP-Nl-ESAT6、pEGFP-Nl-CFP10o (3)用pEGFP-Nl-ESAT6、pEGFP-Nl-CFP10重组真核表达载体转染293T细胞，荧光显微镜观察细胞转染结果。用Western Blot方法对细胞蛋白样进行分析。(4)用激光共聚焦显微镜对转染的293T和U937细胞进行定位分析。（5)对转染的293T细胞用流式细胞仪进行凋亡率分析，用荧光实时定量PCR仪进一步对细胞中凋亡相关基因的变化进行分析。(6)将pEGFP-Nl-ESAT6、pEGFP-Nl-CFPIO重组真核表达载体分别与卡介苗一起联合免疫小鼠，检测其血清中的抗体及IFN-y的变化。结果(1)质粒PCR-、双酶切和测序验证表明pEGFP-NlESAT6、pEGFP-Nl-CFP10重组真核表达载体构建成功。（2)pEGFP-Nl-ESAT6、pEGFP-Nl-CFP10重组真核表达载体转染细胞后表达出绿色荧光，Western Blot结果表明ESAT6、CFP10在细胞内正确表达。（3)激光共聚焦显微镜观察结果显示，转染pEGFP-Nl-ESAT6后，绿色荧光主要分布于293T细胞和U937细胞的细胞质；转染pEGFP-Nl-CFP10后，绿色荧光在293T细胞分布于细胞质，而在U937细胞中绿色荧光除在细胞质分布外，也分布于细胞核的部分区域。（4)流式细胞仪分析结果表明转染pEGFP-Nl-ESAT6、pEGFP-Nl-CFP10组细胞凋亡率均上升，用荧光实时定量PCR进一步分析表明，两组细胞中Caspase8基因的相对表达量在12h、24h、48h时有显著上调，Bcl-2基因在48h时相对表达量有显著下调，Caspase3基因的相对表达量在48h时相对表达量有显著上调，Bax、AIF基因在12h、24h、48h时相对表达量变化不显著。（5)pEGFP-Nl-ESAT6> pEGFP-Nl-CFP10分别与卡介苗一起免疫小鼠两次后，结果表明在小鼠血清中未检测到针对ESAT6、CFP10蛋白的抗体，但小鼠血清中IFN-y水平有显著上升。结论(1)获得了结核杆菌ESAT6和CFP10基因的重组真核表达载体pEGFP-Nl-ESAT6> pEGFP-Nl-CFP10。(2) pEGFP-Nl-ESAT6> pEGFP-Nl-CFP10转染293T细胞后，对细胞有促凋亡的作用，其促凋亡作用主要与影响Caspase8、Bcl-2、Caspase3等基因的表达有关。（3) pEGFP-Nl-ESAT6、pEGFP-Nl-CFP10分别与卡介苗一起免疫小鼠后，小鼠体内细胞免疫水平上升。