论文部分内容阅读
背景:多囊卵巢综合征（PCOS）以持续无排卵、高雄激素血症和卵巢多囊样改变为特征,是育龄期妇女中最常见的生殖内分泌紊乱疾病,具有高发性、异质性、终身性和难治性等特点,亦是引起女性不孕的主要原因。目前,关于PCOS的西医治疗药物主要包括促排卵药、胰岛素增敏剂和降雄激素药物。但其仅限于对症治疗,远期疗效差,且易产生OHSS、卵巢早衰、严重胃肠道不良反应等副作用。因此,需要我们积极从中医药上寻求安全有效的治疗策略。归肾丸加味（MGP）是由张景岳《景岳全书》中的经典名方归肾丸衍生而来,已广泛用于PCOS的临床治疗,疗效显著。但因归肾丸加味成分复杂,其治疗PCOS的分子作用机制仍有待探索。因此本研究通过肠道菌群、网络药理学、代谢组学角度探讨归肾丸加味对PCOS的影响,明确其药物作用机制,寻找最可能的靶向分子。目的:（1）通过16S r DNA高通量基因测序技术检测大鼠肠道菌群,探讨MGP干预后对来曲唑诱导的PCOS模型大鼠肠道菌群的影响,以提炼最有可能的靶向菌群类别,并结合基因、蛋白定量检测结果,探讨MGP对PCOS可能的治疗作用及机制;（2）采用代谢组学结合网络药理学的综合分析方法,从代谢及基因层面共同揭示MGP治疗PCOS的作用机制,寻找最可能的靶向分子。方法:（1）6周龄SPF级雌性SD大鼠予以来曲唑灌胃21天建立PCOS模型。（2）将大鼠随机分为6组:1)空白组、2)模型组、3)达英-35组（diane-35）、4)MGP高剂量组（H.MGP）、5)MGP中剂量组（M.MGP）、6)MGP低剂量组（L.MGP）。（3）HE、ELISA、革兰氏染色等检测MGP对来曲唑诱导的PCOS大鼠的治疗作用。（4）ELISA、IHC、RT-q PCR、WB等检测MGP对来曲唑诱导的PCOS大鼠的抗炎作用及其相关机制。（5）16S r DNA测序方法对PCOS大鼠粪便样品进行测序,评价MGP对PCOS大鼠肠道菌群组成及相对丰度的影响,以寻找最可能的靶向菌群。（6）采用UHPLC-QE-MS血浆非靶标代谢组学鉴别各组血浆差异代谢物,并利用Metabo Analyst平台富集相关代谢通路。（7）利用网络药理学探讨MGP在PCOS治疗中的内源性靶点,以Cytoscape为基础,建立代谢组学与网络药理学的联合网络,综合分析预测MGP治疗PCOS的核心靶点。（8）动物实验采用ELISA、IHC、RT-q PCR、WB等检测验证核心靶点在MGP治疗PCOS中发挥的作用及其相关机制。结果:（1）MGP能有效恢复PCOS大鼠的发情周期紊乱,减少卵巢囊泡数量,促进颗粒细胞和黄体的形成。（2）MGP能显著升高PCOS大鼠血浆FSH、E2水平,降低LH、T水平及LH/FSH比值。同时,MGP能显著降低血浆和卵巢中IL-1β、TNF-α、IL-6和CRP水平,升高IL-10水平。免疫组化分析显示MGP能显著逆转PCOS大鼠卵巢IL-1β、IL-6、TNF-α、CD68免疫浸染面积的增加和IL-10免疫浸润面积的减少。在蛋白水平上,MGP显著降低PCOS大鼠的CD68、p-p65、p-IκBα、p-ERK、p-JNK、p-p38水平,但增加IκBα的表达。在基因水平上,MGP能显著增加PCOS大鼠CD163、CD206、CD200R、IL-10的表达,降低CD68、CD86、IL-1β、IL-6、TNF-α、CRP、p65、ERK、JNK、p38水平。（3）肠道菌群16S r DNA测序结果表明,MGP可以调节肠道菌群结构,恢复肠道菌群稳态。更重要的是,它能显著增加双歧杆菌在目、科和属水平上的相对丰度。（4）相关性分析显示来曲唑诱导的PCOS大鼠肠道菌群属与宿主表型显著相关。（5）血浆非靶标代谢组学共鉴定出54个与MGP治疗PCOS相关的差异代谢物。这些潜在差异代谢物主要参与氨基酸代谢和脂肪酸代谢,可能是MGP在PCOS治疗中的主要生物标志物。（6）网络药理学分析得到的核心基因与代谢组学分析的结果有不同程度的一致性。（7）两种方法综合分析确定了1个新型的关键靶点:e NOS,5个关键代谢物:鸟氨酸、瓜氨酸、L-谷氨酸、乙酰鸟氨酸和羟脯氨酸,以及1个相关途径:精氨酸和脯氨酸代谢。（8）动物实验验证了e NOS在PCOS大鼠卵巢中的表达和定位,并进一步发现MGP可显著改善来曲唑诱导的PCOS大鼠的胰岛素抵抗、减少细胞凋亡和氧化应激,这可能与上调e NOS的表达有关。结论:（1）MGP有效地改善来曲唑诱导的PCOS大鼠的卵巢功能,并对PCOS大鼠具有抗炎作用,这可能与减少巨噬细胞浸润、阻断NF-κB和MAPK通路有关。同时,MGP可调节肠道菌群稳态,重塑肠道菌群结构,尤其是显著增加来曲唑诱导的PCOS大鼠体内双歧杆菌的相对丰度。这些结果为MGP治疗PCOS提供了有力的证据。（2）通过代谢组学结合网络药理学分析揭示e NOS这一新型的潜在靶点以及精氨酸和脯氨酸代谢通路是MGP治疗PCOS的关键环节。动物实验证明MGP可能通过上调e NOS的表达来改善来曲唑诱导的PCOS大鼠的胰岛素抵抗,减少细胞凋亡和氧化应激。综上,本研究为阐明中药复方潜在的药理机制提供了一个范例。