研究背景和目的:糖尿病难愈性伤口作为致残率高、治疗花费高的糖尿病慢性并发症之一,目前对其的治疗主要由伤口护理师通过清创、控制炎症、保持伤口湿润和促进肉芽组织增生等方式完成。所使用的促愈合材料及药物包括:功能性敷料、生长因子、传统中药愈合剂等。尽管有所发展,但仍存在伤口愈合周期并未明显缩短及因长期治疗致使花费高的问题。因此,寻求更高效和经济的促愈合材料及药物仍是临床研究的难点和热点。糖尿病难愈性伤口部位巨噬细胞表型主要为M1型,其很难被极化为M2型巨噬细胞,即在相对异常的糖尿病伤口微环境中,巨噬细胞出现表型转化功能障碍,其抗炎及促修复功能难以发挥,导致创面修复困难。槲皮素作为目前常见的具有较强抗氧化、抗炎作用的黄酮类化合物,广泛存在于山楂、红花等多种中草药中。体外研究表明,槲皮素可促进巨噬细胞表型由M1型向M2型极化。因此,在此基础上,本研究拟通过腹腔注射链脲佐菌素诱导构建SD大鼠糖尿病模型,再经长期高血糖刺激后制备SD大鼠糖尿病皮肤模型,在糖尿病皮肤模型制备成功后行全层皮肤切除术构建难愈性伤口模型,观察槲皮素对糖尿病难愈性伤口愈合的作用效果;并采集伤口部位组织进行组织学及分子生物学分析,探讨槲皮素促难愈性伤口愈合的机制。为进一步研发含有槲皮素的伤口愈合剂提供实验基础,同时也为临床糖尿病伤口的护理提供动物学和分子生物学依据,为临床糖尿病难愈性伤口的护理提供更科学的参考,开拓伤口护理的科研范围,创新出更多实用性的医疗护理产品。研究方法:1.SD大鼠糖尿病皮肤模型的制备:腹腔注射链脲佐菌素构建SD大鼠糖尿病模型,采集持续高糖刺激8周的糖尿病大鼠的皮肤和同周期正常大鼠的皮肤,通过HE染色观察组织病理学变化;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测皮肤中促炎因子(IL-6、TNF-α)、M1型巨噬细胞特异性标记iNOS、M2型巨噬细胞特异性标记Arg-1、血管标记基因CD31、血管内皮生长因子VEGF-α的表达水平,以明确SD大鼠糖尿病皮肤模型构建成功。2.槲皮素对糖尿病大鼠难愈性伤口的促愈合作用的研究:在成功制备SD大鼠糖尿病皮肤模型的基础上,通过全层皮肤切除构建糖尿病大鼠难愈性伤口模型,不同浓度槲皮素局部给药,动态监测伤口愈合率并拍照记录伤口状态变化,观察槲皮素的作用效果;采集给药过程中不同时间点的伤口组织,通过HE染色和Masson染色,从组织病理学角度分析槲皮素对糖尿病难愈性伤口的影响,以明确槲皮素具有对糖尿病大鼠难愈性伤口的促修复作用。3.槲皮素促糖尿病大鼠难愈性伤口愈合机制的研究:采集给药第7天的伤口组织进行免疫组化标记(M2型巨噬细胞特异性标记CD206和M1型巨噬细胞特异性标记iNOS),并进行CD206、iNOS阳性细胞数占比统计,探究槲皮素对巨噬细胞表型极化的调节作用;经RT-qPCR检测槲皮素对血管标记基因CD31、血管内皮生长因子VEGF-α在mRNA水平的表达影响,分析槲皮素与血管新生的关系;RT-qPCR检测槲皮素对促炎因子(IL-6、TNF-α)、抗炎因子IL-10、M2型巨噬细胞特异性标记基因(Msr-1、Arg-1)、M1型巨噬细胞特异性标记基因iNOS在mRNA水平的表达影响,进一步探究槲皮素对伤口部位炎症及巨噬细胞表型的影响,以明确槲皮素促难愈性伤口修复的机制。研究结果:1.SD大鼠糖尿病皮肤模型的制备:与正常大鼠皮肤相比,糖尿病大鼠皮肤中炎症细胞浸润明显增多。糖尿病组促炎因子IL-6、TNF-α表达、M1型巨噬细胞特异性标记基因iNOS和M2型巨噬细胞特异性标记基因Arg-1的表达水平明显高于正常组(P<0.01)。正常组大鼠皮肤中血管相关的CD31和VEGF-α基因的表达水平显著高于糖尿病组(P<0.01)。2.槲皮素对糖尿病大鼠难愈性伤口的促愈合作用的研究:槲皮素治疗组伤口面积较模型组明显缩小,其中高浓度槲皮素组伤口面积减少最多。至伤口愈合第14天,高浓度槲皮素组的伤口愈合率始终最大,10%二甲基亚砜溶剂对照组大鼠伤口愈合率最小。组织病理学显示,槲皮素治疗组在治疗后第7天伤口部位炎症细胞数量明显减少,肉芽组织增多。且槲皮素治疗组的伤口组织胶原蛋白着色强度、成纤维细胞分布程度和血管生成率评分均高于模型组,模型组染色评分与10%二甲基亚砜对照组染色评分之间无统计学差异。3.槲皮素促糖尿病大鼠难愈性伤口愈合机制的研究:采集给药第7天的伤口组织进行免疫组化,结果显示槲皮素治疗组CD206阳性细胞数明显多于模型组。此外,在槲皮素治疗组中,CD206表达呈剂量依赖性增加。免疫组化结果显示CD206阳性细胞在Q-LD(P<0.01)、Q-MD(P<0.01)和Q-HD(P<0.01)对照组的分布数量明显高于模型组。槲皮素治疗组iNOS阳性细胞数明显少于模型组(P<0.01)。免疫组化结果显示iNOS阳性细胞在Q-LD(P<0.01)、Q-MD(P<0.01)和Q-HD(P<0.01)对照组的分布明显低于模型组。槲皮素治疗组iNOS的表达水平与模型组相比,均具有显著性差异,且随着槲皮素浓度的升高,iNOS的表达水平递减(P<0.01)。槲皮素治疗组Msr-1和Arg-1的表达水平与模型组相比,均具有显著性差异,且随着浓度的升高,Msr-1和Arg-1的表达水平递增(P<0.01)。槲皮素治疗组促炎因子IL-6和TNF-α的表达水平与模型组相比,均具有显著性差异,且随着浓度的升高,IL-6和TNF-α的表达水平递减(P<0.01)。槲皮素治疗组抗炎因子IL-10的表达水平与模型组相比,均具有显著性差异,且随着浓度的升高,IL-10的表达水平递增(P<0.01)。槲皮素治疗组血管相关基因CD31和VEGF-α的表达水平与模型组相比,均具有显著性差异,且随着浓度的升高,CD31和VEGF-α的表达水平递增(P<0.01)。研究结论:1.持续8周的高糖刺激,糖尿病大鼠皮肤发生明显组织病理学改变,炎性细胞增多,皮肤处于炎症反应状态,血管减少,SD大鼠糖尿病皮肤模型构建成功。2.槲皮素可以通过促进伤口部位血管新生、肉芽组织增生、胶原纤维沉积,加快糖尿病大鼠难愈性伤口愈合。3.槲皮素可通过促使巨噬细胞向M2型极化,抑制巨噬细胞向M1型极化,减轻糖尿病难愈性伤口部位炎症反应。