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目的:肝癌的基因治疗已经成为肝癌治疗的一大发展方向,本课题拟构建hTERT启动子调控的HSV-TK基因重组腺病毒载体系统,观察Ad-hTERTP-HSV-TK/GCV系统对人肝癌细胞株HepG2的杀伤作用及其过程中旁观者效应的作用,为肝癌的靶向自杀基因治疗提供新的实验依据。方法:1.将穿梭质粒pSU-Tp-TK与腺病毒骨架质粒pBHGE3共转导至HEK293细胞,利用细胞内同源重组法构建出hTERT启动子调控的携带TK基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-HSV-TK载体系统,经PCR鉴定正确后进行扩增、纯化及滴度测定;2.将不同感染复数（MOI=1、10、100、1000）的重组腺病毒Ad-hTERTp-HSV-TK系统感染肝癌细胞HepG2及正常肝细胞L-02,加入不同浓度的GCV（0、1、10、100、1000μg/ ml）,利用MTT法及流式细胞仪检测检测细胞活性;3.将Ad-hTERTp-HSV-TK载体系统感染后的TK阳性HepG2细胞和未感染的TK阴性HepG2细胞按0、1:9、2:8、3:7、……、1混合培养,并分别加入100μg/ ml的GCV, MTT法观察其旁观者效应。结果:1.穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转导HEK293细胞,10天后出现病毒空斑,提取病毒DNA,经PCR鉴定正确并经扩增、纯化后,50%组织培养感染剂量法（TCID50）测定病毒滴度为1.5×1010pfu/ml;2. MTT法检测到肝癌细胞HepG2的存活率随着病毒MOI和GCV浓度的增加而逐渐降低,L-02细胞无明显变化;流式细胞仪检测到当病毒MOI=100,GCV浓度=100μg/ ml时HepG2细胞的凋亡率可达87.02%,而L-02细胞仅为12.51%;3.旁观者效应表明,当TK阳性HepG2细胞为10%时,细胞抑制率已达28.06%;当其为70%时,则达90.44%。结论:1.本实验成功构建了hTERT启动子调控的携带TK基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-HSV-TK载体系统;2.构建的Ad-hTERTp-HSV-TK载体系统,可靶向抑制肝癌细胞HepG2,而对正常肝细胞L-02几乎无影响。