水稻细菌性条斑病（bacterial leaf streak,BLS）和水稻白叶枯病（bacterial leaf blight,BLB）是稻田生态系统中两种重要的细菌病害,分别由水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc）和水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzea,Xoo）引起。在生态环境因子一定的条件下,两个亲缘关系近似的致病变种Xoc和Xoo侵染水稻的致病机制异同性还知之甚少。为了揭示Xoc在水稻上致病机理,本实验室构建了Xoc RS105菌株的Tn5转座子插入突变体库,筛选得到了一个毒性明显降低的突变体Mxoc0031,Tn5转座子插入Xoc＿3248基因上,该基因编码内膜蛋白（Inner membrane protein,Imp）。利用无标记双交换敲除的方法构建imp基因敲除突变体RΔimp:与野生型RS105菌株相比,RΔimp在水稻上的毒性显著降低,细菌生长能力和游动性明显减弱,胞外多糖产量明显降低,糖源利用实验显示imp基因参与了细菌的糖源利用过程。Real-time PCR检测显示,imp基因表达受hrpG和hrpX调控。绿色荧光蛋白GFP标记该内膜蛋白,发现该蛋白具有膜结合特性。功能互补imp基因可以使RΔimp在水稻上的毒性、生长能力、游动性以及胞外多糖产量恢复至野生型水平。前期工作中发现糖酵解和糖异生途径中一个重要代谢酶果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（Fba B）,其与细菌的致病性相关。当该基因突变后,病原菌不能利用丙酮酸和苹果酸进行生长代谢,同时,hrpX和hrpG的表达受到抑制,hrcC、hrpE和hpa3的转录增强。暗示Xoc利用碳水化合物是通过一个未知因子来调控hrp基因的表达的。为了鉴定该未知的调控因子,我们以XocRS105菌株hrpG基因的缺失突变体RΔhrpG为出发菌株,将fba B基因点突变后的启动子（PIP-box由TTCGT-N9-TTCG（?）突变成TTCGT-N9-TTCG（?））与gusA基因融合,导入RΔhrpG突变体内。然后利用Tn5转座子对该融合子基因组进行随机插入,筛选GUS活性增强或减弱的突变体。在8000个突变子中,筛选获得了GUS活性明显减弱的突变体14个,GUS活性明显增强的突变体17个。通过自环化方法对该31个突变体的插入位点进行了基因序列分析。发现Tn5插入的基因位点分别是RNA聚合酶δ54（ACU12＿06395）、苯甲醛脱氢酶（ACU12＿00630）、50Sr RNA甲基转移酶（ACU12＿10245）、膜蛋白（ACU12＿04905）以及β-葡萄糖苷（ACU12＿13855）的编码基因。利用无标记双交换敲除策略,在RS105菌株的基础上获得5个基因的敲除突变体,分别是RΔ418,RΔ340,RΔ312,RΔ092和RΔ912。5个基因的敲除突变体与RS105菌株相比,在水稻上的致病性和生长能力明显降低,但仍能在非寄主植物烟草上产生HR。转录和转录后水平分析表明,在5个基因的敲除突变体中,fba B的表达量明显受到影响。并且,RΔ092和RΔ418突变体的游动性与RS105菌株相比明显减弱,互补子恢复野生型水平;RΔ092突变体碳源利用能力明显降低,互补子恢复野生型水平。vemR::Tn5突变体同样是在上述突变体库筛选中得到的。当Tn5转座子插入vemR基因时,该突变体的GUS活性明显降低。通过无标记双交换敲除方法构建了vemR基因缺失突变体RΔvemR。与野生型RS105菌株相比,RΔvemR在寄主植物水稻上丧失了致病性和在非寄主植物烟草上丧失了激发HR的能力,并且突变体的胞外多糖产量和游动性明显降低。通过细菌形态观察,发现该突变体菌体形态发生了明显的变化。结构分析发现,VemR只有一个REC（Che Y-homologous receiver domain）结构域,属双组分调控系统因子,但其如何接受信号和将信号传递给其他因子,从而决定病原菌在寄主植物上的致病性的机制不详。为此,利用蛋白质互作预测和TAP-质谱联用等途径,以期发现VemR的互作蛋白以及其相对应的信号供体组氨酸激酶。试验结果发现,AtoC可以磷酸化VemR,磷酸化位点位56位的天冬氨酸。Vem R被磷酸化后,可以将信号传递给包括2-OD、RR、CcmA、Hcp、PilT、HK、FlgA、MinD和HrpG等蛋白。这些蛋白基因分别控制着细菌糖代谢、游动性、细胞分裂和T3SS（type-Ⅲ secretion system）形成等相关性状。这些结果说明,Vem R蛋白是全局性信号调控因子,接受信号来源多样和传递信号来源多样,暗示其是潜在性的药物靶点。Xoo和Xoc中存在数量众多的转录激活因子（Transcription activator-like effectors,TALEs）,通过T3SS分泌进入水稻细胞核,激活水稻中相应的S或R基因的转录表达,使水稻表现为感病或者抗病。在水稻中已经鉴别出多个R基因可被Xoo的TALE蛋白激活,但不被Xoc的TALE激活。为了揭示抗BLB的水稻材料不抗BLS的原因,我们首先将Xoo菌株中的avr Xa7（对应Xa7）以及avr Xa27（对应Xa27）两个的tal基因分别导入Xoc强毒性菌株RS105和弱毒性菌株YNBO-17中。实验发现,当YNBO-17菌株分别带有avr Xa7和avr Xa27时,注射含有相应R基因（Xa7,Xa27）的水稻时,水稻产生HR反应。但当RS105菌株中分别含有这两个tal基因时,注射相同品种的水稻,只有含有Xa27的水稻产生HR,而含有Xa7的IRBB7水稻仍然表现为感病性,提示Avr Xa7-Xa7介导的抗性被RS105菌株中某种未知因子抑制了。Southern杂交发现,YNBO-17菌株含9个tal基因,而RS105菌株含有约24个,有可能是RS105菌株某个tal基因的存在导致了该现象的产生。逐一分离RS105菌株的tal基因并与Avr Xa7一同表达导入YNB0-17菌株中发现,RS105菌株来源的tal7基因可在YNBO-17菌株中有效抑制avr Xa7-Xa7介导的水稻免疫反应。利用TALE-NT软件预测发现,Tal7在水稻上存在5个候选的靶基因。GUS和Real-time PCR试验发现,在Tal7存在时,水稻Os09g29100和Os12g42970基因的表达活性最强,提示这两个水稻基因是Tal7的靶标基因。通过EMSA和MST试验发现,Tal7可结合水稻Os09g29100和Os12g42970基因的启动子上。非常惊讶的是,Avr Xa7也能结合这两个基因的启动子,并且其结合能力明显比Tal7的强。根据Tal7结合位点旁侧DNA序列设计dtal,置于tal-free的菌株中表达,与含有avr Xa7的PH菌株进行不同时间和相同位置的注射接种,在含有Xa7的IRBB7水稻上发现,只有Os09g29100被dtal激活表达后,Avr Xa7-Xa7介导产生的抗病反应才被抑制,暗示水稻Os09g29100基因的激活表达,改变了Avr Xa7-Xa7抗性的产生。通过TALEN技术,对日本晴水稻中Tal7结合Os09g29100基因的EBE进行突变修饰,发现该EBE被修饰后,突变体水稻对含有tal7基因的Xoc菌株的抗病性明显提高,提示水稻Os09g29100基因是含有tal7基因的Xoc的感病基因,在BLS发生过程中起作用。这些结果表明,Xoc与水稻共进化过程中tal基因的不同,导致Xoc菌株在水稻上的致病力不同,也揭示了抗白叶枯病水稻不抗水稻条斑病的原因。