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氯酚类化合物常被用作木材防腐剂、杀菌剂、农药和除草剂等,由于其难以降解,在环境中特别是水体中能稳定存在,不仅影响水生生物的生长和繁殖,还可以通过食物链进入人体,危害人体健康,是一类主要的环境污染物。2，4-二氯苯酚(2,4-DCP)作为氯酚类化合物的一种,主要用于除草醚、2,4-滴以及药物硫双二氯酚的合成,由于其大量用于工农业并被释放到环境中,对生物产生毒性影响,美国和中国等许多国家都已将2,4-DCP列入了优先控制污染物的名单。2,4-DCP不仅能影响生物体的生长、发育和生殖,还可以在细胞和分子水平导致氧化应激、促使自由基的产生,影响相关基因的表达,甚至引起细胞死亡。细胞凋亡是指程序性的细胞死亡,可由线粒体信号或死亡受体等介导发生。已有研究证明2,4-DCP可以诱导细胞凋亡,但其诱导细胞凋亡的信号途径和分子机制尚不清楚。本实验以草鱼的原代肝细胞为材料,通过测定2,4-DCP染毒后细胞的活力、细胞凋亡和线粒体膜电位,检测细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的含量及凋亡相关因子caspase-3、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associated X protein, Bax)、Bcl-2、TNF-α和IAP的mRNA表达情况,探讨了2,4-DCP诱导细胞凋亡的信号途径；通过加入外源性线粒体保护剂乙酰左旋肉碱盐酸(Acetyl-L-carnitine hydrochloride, ALC)进一步验证了线粒体信号途径在2,4-DCP诱导细胞凋亡过程中的作用,最终揭示了2,4-DCP诱导细胞凋亡的具体途径及分子机制,为2,4-DCP毒性作用机理的研究提供一定的科学依据。本论文具体研究结果如下：1.2,4-DCP暴露可以抑制草鱼原代肝细胞的细胞活力。本实验使用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)检测2,4-DCP对草鱼原代肝细胞细胞活力的影响,结果显示：与对照组相比,2,4-DCP (0.50、1.00mM)暴露12h可以引起草鱼原代肝细胞细胞活力的显著降低(P<0.05)。2.2,4-DCP暴露可以诱导草鱼肝细胞的凋亡。使用荧光显微镜观察和流式细胞仪检测2,4-DCP对草鱼原代肝细胞细胞凋亡的影响,与对照组相比,2,4-DCP (0.10、0.50mM)暴露12h显著增加了草鱼原代肝细胞的凋亡率(P<0.05)。3.2,4-DCP暴露可以引起草鱼肝细胞线粒体膜电位的降低。使用荧光分光光度计检测2,4-DCP对草鱼原代肝细胞线粒体膜电位的影响,检测到与对照组相比,2,4-DCP (0.10、0.50mM)暴露12h可以显著降低草鱼原代肝细胞的线粒体膜电位(P<0.05)。4.2,4-DCP暴露可以导致草鱼肝细胞的ROS的产生。使用流式细胞仪检测细胞内ROS爆发的时间点和ROS水平的变化,与对照组相比,2,4-DCP (0.10、0.50mM)暴露12h没有引起ROS的显著升高(P>0.05),但暴露5h可以引起细胞内ROS的显著升高(P<0.05)。5.2,4-DCP暴露可以诱导草鱼肝细胞凋亡相关基因的改变。使用实时定量PCR (qPCR)检测2,4-DCP对凋亡相关基因mRNA表达量的影响,与对照组相比,2,4-DCP可以导致caspase-3、TNF-α和Bax mRNA的表达量以及Bax/Bcl-2mRNA比值的升高(P<0.05)。6.ALC (5mM)抑制了2,4-DCP导致的草鱼肝细胞的凋亡,并显著恢复了线粒体膜电位(P<0.05),降低了caspase-3、TNF-α和Bax mRNA的表达量(P<0.05)以及Bax/Bcl-2mRNA的比值(P<0.05)。7.2,4-DCP暴露引起草鱼肝细胞IAP mRNA表达量的下降,但对草鱼IAP蛋白的表达没有影响。研究结果显示2,4-DCP导致草鱼肝细胞IAP mRNA表达量的变化。我们进一步利用生物信息学技术手段设计IAP基因的特异性引物,扩增IAP基因片段,运用原核表达系统表达抗原,免疫新西兰大白兔,获得抗血清后,通过亲和纯化得到IAP蛋白特异性的抗体并使用免疫印迹检测了2,4-DCP诱导的草鱼肝细胞中IAP蛋白的表达。然而,与对照组相比,2,4-DCP (0.10、0.50mM)对草鱼肝细胞LAP蛋白的表达没有明显影响(P>0.05)。以上结果表明：2,4-DCP诱导的草鱼肝细胞的凋亡是通过线粒体信号途径介导的。2,4-DCP染毒细胞后通过产生ROS引起氧化应激,降低线粒体膜电位,改变caspase-3和Bax mRNA的表达以及Bax/Bcl-2比值,最终导致细胞凋亡。