在哺乳动物个体发育中,神经系统的发育是一个非常复杂的过程。其中,神经元分化对于神经系统的形成是非常重要的。神经元分化过程中,信号分子与细胞增殖、细胞周期、细胞分化紧密协调,调控神经细胞的发育与成熟。探讨神经元分化调控的分子机制对于神经发育、神经再生、神经系统退行性疾病,以及脑肿瘤的发生发展和治疗有重要意义。拓扑异构酶IIβ（Topoisomerase IIβ,Topo IIβ）是促进神经发育和神经元分化的关键蛋白质。腺病毒E2转录结合因子-1（E2F1）是一个重要的转录因子,在细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化进程中,发挥着重要作用。西洛他唑（cilostazol,CLZ）是抗血小板类药物,对神经元损伤有保护作用,而且最近有研究报道CLZ可干扰E2F1与其靶基因的结合,促进神经元分化,但其确切作用机制尚不明确。因此,本研究以人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞为神经元分化模型,通过外源性上调E2F1的表达,检测细胞分化过程中E2F1和Topo IIβ的表达变化,进而探讨神经元分化的分子机制,为临床神经系统疾病的研究与治疗提供一些依据。本研究共分三部分。第一部分E2F1对维甲酸诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化的影响目的:研究转录因子E2F1转染SH-SY5Y细胞后,观察其对细胞生长状况的影响,以及与维甲酸（Retinoic acid,RA）诱导神经元分化之间的关系。方法:1细胞培养:SH-SY5Y细胞以DMEM培养基培养,置37℃、饱和湿度、5%CO₂环境下培养,待细胞进入对数生长期后进行实验操作。2 E2F1质粒转染:E2F1过表达质粒用Lipofectamine 2000转染SH-SY5Y细胞,倒置荧光显微镜、q RT-PCR以及Western blot观察转染效率。3诱导分化:E2F1过表达质粒转染SH-SY5Y细胞后,加入维甲酸（RA）10μmol/L诱导分化3d。4细胞生长状况检测:MTT检测转染前后细胞生长指数,并绘制生长曲线,倒置显微镜观察转染前后细胞分化形态。5细胞周期检测:收集各组细胞,流式细胞术检测G0/G1、S和G2/M期细胞百分比。6各组细胞神经元分化的鉴定:神经元突起生长的检测;MAP2表达的免疫荧光及蛋白印迹检测。7统计学方法:实验结果以x±s表示,单因素方差分析（One-Way ANOVA）,P<0.05为有显著性意义。结果:1 SH-SY5Y细胞呈贴壁、簇状生长,胞体小而圆,大多数为不规则形,少数呈梭形,有较短的神经突起。2倒置荧光显微镜、q RT-PCR以及Western blot检测转染效率E2F1过表达质粒带有绿色荧光,Lipofectamine 2000转染E2F1过表达质粒进入SH-SY5Y细胞1d、2d、3d后,倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况,从而判断转染效率在80%以上。转染后提取E2F1总RNA及总蛋白,采用q RT-PCR以及Western blot技术检测,在E2F1过表达细胞中E2F1的m RNA及蛋白水平都有显著增高,与未转染组和空载体组相比,有显著性差异（P<0.05）。说明过表达E2F1质粒已经成功转染进入SH-SY5Y细胞。3细胞生长状况SH-SY5Y细胞转染E2F1过表达质粒后,MTT结果显示:与对照组（Con）相比,E2F1过表达组（over）细胞生长最快,二者有显著性差异（P<0.05）。转染后加入10μmol/L RA诱导分化,诱导组（Con+RA）与对照组（Con）相比,细胞生长速度明显降低,而E2F1过表达组加入RA后（over+RA）,生长速度没有明显降低,与对照组没有显著性差异。4细胞分化形态学变化E2F1过表达质粒转染SH-SY5Y细胞,加入或不加10μmol/L RA诱导分化,3 d后倒置显微镜下观察:RA未处理组中,过表达组（over）细胞形态与对照组（Con）相比,无明显区别;在RA处理组中,与未诱导组相比,RA诱导分化组细胞数目减少,胞体聚集生长,神经突起长度明显增长。对单个细胞平均神经突起长度测量,结果显示:Con+RA组与Con组相比,有显著性差异（P<0.05）;而over+RA组的SH-SY5Y细胞突起长度增加不明显。5转染E2F1过表达质粒对细胞周期分布的影响E2F1过表达质粒转染SH-SY5Y细胞后,流式结果显示:E2F1过表达组（over）G0/G1期细胞比对照组（Con）减少了7.354%,S期增加了5.071%,与对照组（Con）相比,二者有显著性差异（P<0.05）,而空载体组（over C）与对照组（Con）相比没有显著性差异。转染后RA诱导细胞分化3 d,Con+RA组与Con组细胞相比,G0/G1期细胞明显增多,比Con组增加了23.597%,S期细胞明显降低,减少了28.410%,表明发生了G0/G1期阻滞（P<0.05）;over+RA组与Con组细胞相比,G0/G1期细胞增加了8.224%,S期减少了9.942%（P<0.05）。提示RA可诱导细胞周期阻滞,过表达E2F1可促进细胞周期进程。6神经元分化的鉴定采用神经元分化标志分子,微管相关蛋白2（microtubule-associated protein 2,MAP2）鉴定神经元分化。免疫荧光染色结果表明,E2F1过表达组（over）与对照组（Con）相比,MAP2的表达较弱;10μmol/L RA处理SH-SY5Y细胞后,MAP2不仅在细胞质中的表达增加,而且在神经元的突起中表达也明显增加,Con+RA组与Con组细胞相比,有明显增加。而over+RA组MAP2表达量较低,与Con组相比,没有明显区别。Western blot检测MAP2表达,显示的结果与免疫荧光结果一致。结论:SH-SY5Y细胞经10μmol/L RA诱导可使细胞脱离细胞周期,并向神经元分化;E2F1过表达可促进SH-SY5Y细胞增殖,降低神经元分化;研究结果表明,细胞内E2F1水平可影响神经元分化,其具体机制尚需进一步研究。第二部分E2F1通过负调控Topo IIβ表达抑制SH-SY5Y细胞向神经元分化目的:检测E2F1和Topo IIβ表达对SH-SY5Y细胞向神经元分化的影响。方法:1细胞培养:SH-SY5Y细胞以DMEM培养基培养,置37℃、饱和湿度、5%CO₂培养箱内培养。2免疫荧光、q RT-PCR以及Western blot检测E2F1过表达质粒转染细胞后对Topo IIβ表达变化的影响。3 q RT-PCR和Western blot技术检测细胞周期相关蛋白p27、cyclin D1、CDK4、E2F1 m RNA及蛋白表达变化的影响。4染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay,Ch IP）检测E2F1在Topo IIβ基因启动子区的募集与结合。5统计学方法:同第一部分。结果:1转染E2F1过表达质粒对细胞中Topo IIβ表达变化的影响免疫荧光染色结果显示:Topo IIβ的表达在细胞核中,E2F1过表达组（over）与对照组（Con）相比,Topo IIβ的表达较弱,而空载体组（over C）与对照组（Con）相比没有显著性差异。10μmol/L RA诱导SH-SY5Y细胞后,Con+RA,over C+RA组与Con组细胞相比,Topo IIβ表达明显增加,而over+RA组Topo IIβ表达量低于Con组。q RT-PCR以及Western blot检测的结果与免疫荧光结果一致。2 q RT-PCR检测p27、cyclin D1、CDK4、E2F1 m RNA表达与对照组细胞相比,E2F1过表达组（over）的p27 m RNA表达量明显降低（P<0.05）,而cyclin D1、CDK4、E2F1 m RNA的表达高于对照组（P<0.05）。空载体组（over C）与对照组（Con）相比没有显著性差异。RA诱导后,Con+RA、over C+RA组与Con组细胞相比,p27 m RNA表达明显增加（P<0.05）,而over+RA组表达量低于Con组（P<0.05）;对于cyclin D1、CDK4、E2F1 m RNA的表达,Con+RA组低于Con组（P<0.05）,而over+RA组高于Con组（P<0.05）。3 Western blot检测p27、cyclin D1、CDK4、p-Rb、E2F1蛋白的表达与Con相比,over中p27蛋白的表达量明显降低（P<0.05）,而cyclin D1、CDK4、p-Rb、E2F1蛋白的表达高于Con（P<0.05）,over C与Con相比没有显著性差异。RA诱导后,Con+RA、over C+RA与Con细胞相比,p27蛋白表达明显增加（P<0.05）,而over+RA组的表达量低于Con组（P<0.05）;对于cyclin D1、CDK4、p-Rb、E2F1蛋白的表达,Con+RA组低于Con组（P<0.05）,而over+RA组高于Con组（P<0.05）。4 E2F1在转录水平负反馈调节Topo IIβ的表达Ch IP检测显示,Topo IIβ基因启动子区有E2F1的结合位点,E2F1过表达组中,结合在Topo IIβ上的E2F1表达水平较对照组明显升高了（P<0.05）。RA诱导后,随着诱导分化时间的延长,特异性结合在Topo IIβ基因启动子区的E2F1逐渐减少,Con+RA组的表达量低于Con组（P<0.05）,over+RA组高于Con组（P<0.05）。说明结合在Topo IIβ基因启动子区的E2F1与细胞的分化状态成反比,高表达的E2F1在RA诱导SH-SY5Y细胞分化过程中,通过抑制Topo IIβ的表达,抑制了细胞的分化。结论:RA诱导可降低SH-SY5Y细胞中E2F1的表达,诱导神经元分化,其作用与Topo IIβ的表达上调有关;细胞内E2F1水平增高可促进细胞周期相关蛋白的表达,抑制神经元分化;E2F1可作用于Topo IIβ基因启动子,在神经元分化进程中调控Topo IIβ表达;高表达的E2F1增强了其在Topo IIβ基因启动子区的募集,抑制Topo IIβ的表达,进而抑制神经元分化。第三部分西洛他唑通过E2F1/Topo IIβ途径诱导神经元分化目的:探讨CLZ诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化过程中,Topo IIβ的表达变化,以及E2F1/Topo IIβ途径对神经元分化的影响及其机制。方法:1细胞培养:SH-SY5Y细胞用含10%胎牛血清,100 U/m L青霉素,100μg/m L链霉素的DMEM培养基,置37℃、5%CO₂培养箱内培养。2 MTT检测CLZ对SH-SY5Y细胞的作用浓度。3细胞分化百分率检测:不同浓度的CLZ作用于人SH-SY5Y细胞,分别在0⁵ d观察、测量各组细胞突起长度的变化。以单个细胞总突起长度大于100μm作为细胞分化标准,计算细胞分化百分率。4细胞分化形态学观察:30μmol/L CLZ作用于人SH-SY5Y细胞0³d,观察CLZ处理前后细胞形态学变化,检测分化情况。5神经元分化的鉴定:免疫荧光及Western blot技术检测神经元分化标志蛋白MAP2的表达。6 Topo IIβ的表达:分别用免疫荧光、q RT-PCR技术以及Western blot检测Topo IIβ在CLZ处理前后的表达变化。7 q RT-PCR技术以及Western blot检测p27、E2F1、PCNA在m RNA和蛋白水平的表达变化。8 Ch IP检测E2F1在Topo IIβ以及增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）基因启动子区的结合。9统计学方法:同第一部分。结果:1 MTT结果显示:不同浓度的CLZ（10、20、50、100、200、400μmol/L）作用于SH-SY5Y细胞1、2、3、4、5 d后可抑制细胞的增殖,随着CLZ浓度的增加和培养时间的延长,其对细胞增殖的抑制作用逐渐增大,与对照组相比,具有统计学意义（P<0.05）。提示CLZ对SH-SY5Y细胞增殖的抑制作用具有浓度和时间依赖性。应用半数抑制浓度（IC50）计算软件计算CLZ对SH-SY5Y细胞的IC50:第1⁵ d分别为:167.472±6.289、76.334±2.549、36.629±3.148、31.382±2.148、28.146±1.485μmol/L。2细胞分化百分率CLZ诱导细胞向神经元分化过程中,10、20、50μmol/L CLZ在1³ d细胞分化百分率逐渐增加,第3 d达到最高,结合MTT计算的CLZ对SH-SY5Y细胞第1⁵ d的IC50结果,因此选用30μmol/L CLZ诱导细胞分化3 d,进行以下实验。3细胞分化形态学变化与对照组相比,CLZ诱导组细胞逐渐出现增殖速度下降,细胞数目减少,突起伸出,且突起数量和长度逐渐增加。诱导第3 d,细胞具有多个细长突起,且突起的长度明显增长,交织成网状,具备成熟神经元的形态特点,与对照组细胞相比有显著性差异（P<0.05）。4神经元分化的鉴定免疫荧光检测MAP2表达情况,结果显示:30μmol/L CLZ诱导细胞向神经元分化3 d后,突起长度明显增加,与对照组细胞相比有明显差异（P<0.05）。Western blot同样显示MAP2蛋白表达增高,与对照组细胞相比有显著性差异（P<0.05）,说明30μmol/L CLZ可以诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化。5 Topo IIβ的表达检测免疫荧光检测Topo IIβ表达情况,结果显示:CLZ诱导组细胞核染色明显加深,q RT-PCR、Western blot均显示Topo IIβ表达增高,与对照组细胞相比有明显差异（P<0.05）。6 p27、E2F1和PCNA的表达变化CLZ诱导细胞向神经元分化过程中p27在m RNA和蛋白水平均高于对照组细胞,有明显差异（P<0.05）,而E2F1、PCNA均低于对照组细胞,有显著性差异（P<0.05）,说明30μmol/L CLZ可以诱导细胞周期阻滞,抑制细胞增殖。7 CLZ影响E2F1在Topo IIβ和PCNA基因启动子区的结合Ch IP检测显示,CLZ诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化过程中,结合在Topo IIβ和PCNA基因启动子区的E2F1蛋白受到明显抑制（P<0.05）。提示:E2F1/Topo IIβ途径参与了CLZ诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化,CLZ促进了Topo IIβ的转录表达,抑制了细胞的增殖,促进了细胞的分化。结论:本部分研究以E2F1正向调控的靶基因PCNA作为对照,探讨了CLZ对E2F1和Topo IIβ表达的影响。结果提示,CLZ可通过抑制E2F1与Topo IIβ基因结合作用,诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化;从而进一步证明E2F1/Topo IIβ信号途径参与了神经元的分化,并为有关神经发育的研究,相关药物开发及有关神经系统疾病的治疗,提供了新的分子靶点。