目的:血管中血液的正常流动对维持机体的正常供血、供氧具有非常重要的意义。通常情况下,血管内无血液凝固和血栓形成;一旦血管内有血栓形成,就将导致机体组织器官的缺血、缺氧甚至损伤。中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)是中性粒细胞(neutrophil,PMN)在适宜刺激条件下释放到胞外的一种纤维网格样结构。NETs主要由PMN释放的细胞DNA和胞浆蛋白组成,其中含量最多的蛋白是组蛋白(histone),其次是中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)和髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)。最近有越来越多的文献认为,NETs参与血管内血栓的形成,与脓毒症、自身免疫性疾病、糖尿病甚至肿瘤等疾病密切相关。因此,研究NETs参与疾病发生的分子机制、寻找有效的治疗手段具有重要意义。白蛋白(albumin,ALB)是血管中含量最高的蛋白质,在维持机体内环境中发挥重要作用,具有维持血浆胶体渗透压和血容量、运输和结合药物或内源性物质以及抗氧化的作用,临床上用于失血性休克、肝硬化伴腹水水肿、成人呼吸窘迫综合征、恶性肿瘤等治疗。我们实验室偶然发现,在无血清培养基中PMN可以释放NETs,但是在加入血清后NETs生成受到抑制,提示血清中存在某种具有抑制NETs生成的成分。我们知道,血管中有着大量的PMN,但在正常生理状态下却很少有NETs生成,如果自发生成大量的NETs,则可造成血管栓塞甚至休克、DIC。基于我们的上述发现,我们推测血管中应该存在对NETs生成具有精密调控作用的物质,但是该物质及其参与的调控机制尚不清楚。为此,我们设计了一系列实验开展血浆中具有抑制NETs生成的物质基础以及分子机制的研究,旨在阐明血管内抑制NETs生成的物质基础及调控机制。方法:一、人中性粒细胞的分离与NETs的检测1健康人中性粒细胞(PMN)的分离:采取健康人外周静脉血,采用人中性粒细胞分离液试剂盒分离中性粒细胞。2中性粒细胞培养基体系:将100%DMEM培养液作为标准PMN培养基体系,加于35mm激光共聚焦培养皿中;培养基体系中PMN细胞终浓度为5.0 × 105/ml。3中性粒细胞的鉴定:采用瑞氏染色和台盼蓝实验鉴定分离后的细胞种类及PMN的存活率。4NETs的检测:将PMN在CO2培养箱(37℃、5%CO2)中孵育 2h 后,加入 DNA 染料 sytox 绿/sytox 橙色[sytox green/sytox orange,培养基中终浓度为5 mM(后面涉及的浓度均为培养基中的终浓度)],并在激光共焦显微镜下观察绿色/红色荧光情况,采用ZEN widefield软件进行平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)的测定(后续实验中均采用此方法进行NETs的检测,方法不再赘述)。二、血清抑制NETs生成作用的再确认与成分筛选1确认血清对NETs的作用:检测在标准PMN培养基体系、含有10%胎牛血清(FBS)、10%人血清(HBS)的标准PMN培养基体系中NETs的生成量。2血浆成分的超滤:使用不同分子量规格(3 kDa、30 kDa、50 kDa、100 kDa)的超滤离心管对人血清进行超滤,获得不同分子量段的人血清组分。3各分子量段血浆组分对NETs作用的确认:将不同分子量段人血浆组分加入标准PMN培养基体系中培养2 h,检测各个分子量血浆组分实验组中NETs的生成量,初步确认具有抑制NETs作用的血浆组分的分子量范围。三、血浆中具有抑制NETs生成作用的蛋白质成分的筛选与确认1血液中蛋白的选取:通过复习文献在有抑制NETs作用的血浆组分分子量范围中选取血液中常见且重要的蛋白,并在该蛋白的生理浓度范围内选取某一值作为实验生理浓度。2血液蛋白对NETs生成的影响:将上述选取的蛋白以10%实验生理浓度加入标准PMN培养基体系,检测对NETs作用的影响;分析有NETs抑制作用的蛋白中最常见且重要的蛋白,将其作为主要研究对象。四、抑制NETs关键蛋白酶后白蛋白对NETs作用的研究1抑制MPO后白蛋白对NETs作用:将MPO抑制剂(终浓度为100 nM)加入含 BSA(0.5 mg/ml、1.5 mg/ml、4.5 mg/ml)的标准PMN培养基体系中,检测NETs生成量的变化。2抑制NE后白蛋白对NETs作用:将NE抑制剂(终浓度为100 nM)加入含 BSA(0.5 mg/ml、1.5 mg/ml、4.5 mg/ml)的标准 PMN培养基体系中,检测NETs生成量的变化。3抑制PAD4后白蛋白对NETs作用:将PAD4抑制剂(终浓度为 100 nM)加入含 BSA(0.5mg/ml、1.5mg/ml、4.5 mg/ml)的标准PMN培养基体系中,检测NETs生成量的变化。五、抗人血清白蛋白抗体对白蛋白抑制NETs作用的影响1抗人血清白蛋白抗体与人白蛋白的预孵:配置200 μg/ml HSA,将抗人血清白蛋白抗体加入200 μg/ml HSA溶液,放入CO2培养箱(37℃、5%CO2)过夜。2检测孵育抗体后对白蛋白抑制NETs的影响:将4种PMN培养基体系(无白蛋白,抗人血清白蛋白抗体,200 μg/ml HSA,200 μg/ml结合抗体的HSA)进行NETs检测。六、氧化或还原状态的牛血清白蛋白的抗NETs作用1氧化状态的BSA的制备:将BSA(40mg/ml)与H2O2(45mM)在室温孵育1h,将孵育后的BSA进行冻干,获得氧化状态的BSA。通过BCA蛋白浓度测定法测定氧化状态BSA浓度,并将其浓度调整为 40 mg/ml。2还原状态的BSA的制备:将BSA(40 mg/ml)与胱氨酸(17mM)在37℃孵育24 h后,采用PD-10脱盐柱脱去残留的胱氨酸;将柱流出液进行冻干,获得还原状态的BSA。通过BCA蛋白浓度测定法测定还原状态BSA浓度,并将其浓度调整为40 mg/ml。3氧化或还原状态的BSA对NETs的影响:对氧化或还原状态BSA(4 mg/ml)加入标准PMN培养基体系进行NETs生成量的检测,并与正常的BSA结果进行比较,确定氧化或还原状态的BSA对NETs的影响。七、脂多糖和大肠埃希菌存在情况下牛血清白蛋白抑制NETs的作用1 脂多糖存在情况下牛血清白蛋白抑制NETs的作用1.1 LPS存在情况下不同浓度BSA抑制NETs的作用1.1.1低浓度LPS存在情况下实验生理浓度BSA抑制NETs的作用:将 LPS(终浓度:20ng/ml、40 ng/ml、80 ng/ml、160 ng/ml)加入含有生理浓度BSA(40mg/ml)的标准PMN培养基体系中,检测NETs生成量。1.1.2高浓度LPS存在情况下不同浓度BSA抑制NETs的作用:将 LPS(终浓度:160ng/ml,320ng/ml,640ng/ml)加入含有 BSA(40 mg/ml,5mg/ml)的标准PMN培养基体系中,检测NETs生成量。1.2 LPS存在情况下BSA抑制NETs的量效关系:将LPS(终浓度:320 ng/ml)加入含有 BSA(0.5 mg/ml、1.5 mg/ml、4.5 mg/ml)的PMN培养基体系中,检测NETs的生成量。2大肠埃希菌存在情况下牛血清白蛋白抑制NETs的作用2.1 EC存在情况下不同浓度BSA抑制NETs的作用2.1.1高浓度EC存在情况下不同浓度BSA抑制NETs的作用:将高浓度EC(2.9×107)加入含有不同浓度BSA(0.16mg/ml,0.5 mg/ml,1.5 mg/ml,4.5mg/ml,40mg/ml)的 PMN 培养基体系中,检测 NETs生成量的变化。2.1.2低浓度EC存在情况下不同浓度BSA抑制NETs的作用:由于之前实验中EC浓度过高,于是降低EC浓度进行实验,将EC(2.5×105)加入含有不同浓度 BSA(0.16mg/ml,0.5 mg/ml,1.5mg/ml,4.5 mg/ml,40 mg/ml)的PMN培养基体系中,检测NETs生成量的变化。2.2 EC存在情况下BSA抑制NETs生成的动态观察:将50 μl EC(5.0×106)加入含有BSA(1.5 mg/ml)的标准PMN培养基体系中,在三个时像点(30min、60min、120min)进行NETs观察以检测EC是否会影响NETs的生成速率。八、Ca2+浓度与Ca2+通道阻断剂对白蛋白抑制NETs作用的影响1有Ca2+和无Ca2+培养基对NETs的生成的影响:PMN分别在有钙PMN培养基体系和无钙PMN培养基体系中孵育,观察NETs生成情况。2不同Ca2+浓度对NETs生成的影响:将有Ca2+、无Ca2+ DMEM作为基础养基,配置成含有不同Ca2+浓度(0%、0.625%、1.25%、2.5%、5%、10%、20%)的PMN培养基体系,将PMN在上述浓度培养基中孵育2 h,观察NETs生成情况的差异。3钙离子通道阻断剂对NETs生成的影响3.1 2-氨乙氧基二苯酯硼酸(2-APB)对HSA抑制NETs作用的影响:将2-APB(终浓度为5μM)加入含有HSA(1.5 mg/ml、4.5 mg/ml)的标准PMN培养基体系中,检测NETs生成量。3.2维拉帕米对NETs生成的影响:将维拉帕米(终浓度为10 μM)加入标准PMN培养基体系中,检测NETs生成量。九、牛血清白蛋白对中性粒细胞胞内总活性氧和线粒体活性氧水平的影响1BSA对PMN胞内总活性氧(ROS)水平的影响1.1 PMN内ROS水平的检测:将PMN加入含10%BSA的标准PMN培养基体系,并于CO2培养箱(37℃、5%CO2)孵育20min,在培养基体系加入ROS荧光探针DCFH-DA(10 μM)并孵育30 min后取出,轻轻吹打使贴壁的PMN脱落,将其避光收集至1.5ml EP管内,采用流式细胞仪检测ROS活性氧探针的荧光强度。1.2不同种类蛋白对PMN内ROS的影响:标准PMN培养基体系中分别加入 B SA(4 mg/ml)、HSA(4 mg/ml)、apo Al(0.14 mg/ml)、HDL(0.3 mg/ml),采用流式细胞仪检测ROS活性氧探针的荧光强度。2 BSA对PMN内线粒体活性氧(mitoROS)水平的影响2.1 PMN内mitoROS水平的检测:将含10%FBS的标准PMN培养基体系,并于CO2培养箱(37℃、5%CO2)孵育20min,在培养基体系加入mitoROS荧光探针MitoSOX Red并孵育30 min后取出,轻轻吹打使贴壁的PMN脱落,将其避光收集至1.5 ml EP管内,采用流式细胞仪检测mitoROS活性氧探针荧光强度。2.2线粒体呼吸链干扰剂对白蛋白抑制NETs生成的影响:呼吸链干扰剂中抗霉素A(antimycin A)是mitoROS生成抑制剂,鱼藤酮(rotenone)是mitoROS生成促进剂。在标准PMN培养基体系中分别加入2 μl抗霉素(终浓度为20 μM)、5 μl鱼藤酮(终浓度为10μM),通过检测mitoROS荧光探针及NETs生成量的变化,进一步明确mitoROS在NETs生成中的作用。2.3不同种类蛋白对PMN内mitoROS水平的影响:标准PMN培养基体系中分别加入BSA(终浓度为4 mg/ml)、HSA(终浓度为4 mg/ml)、apo A1(终浓度为 0.14 mg/ml)、HDL(终浓度为 0.3 mg/ml),采用流式细胞仪检测荧光探针的荧光强度。十、自噬干扰剂对白蛋白抑制NETs作用的影响1自噬抑制剂对白蛋白抑制NETs作用的影响:将3-MA(终浓度为 1 mM)加入含有 BSA(0.5 mg/ml、1.5 mg/ml、4.5 mg/ml)的标准PMN培养基体系中,观察NETs生成情况。2自噬激动剂对白蛋白抑制NETs作用的影响:将RAPA(5 mM)加入含有 3 种不同浓度的 BSA(0.5 mg/ml、1.5 mg/ml、4.5 mg/ml)PMN培养基体系中,观察NETs生成情况。3 CaMKK抑制剂对NETs生成的影响:将STO 609(50 μM)加入标准PMN培养基体系中,检测NETs生成量。结果:一、人中性粒细胞的分离与NETs的检测1健康人中性粒细胞(PMN)的分离、培养与鉴定:通过人外周血PMN分离液试剂盒按照说明分离出目标细胞;并通过瑞士染色观察到该细胞核呈杆状和4分叶状,胞质中含有紫红色颗粒,可以确认分离得到的细胞为PMN,通过台盼蓝排斥实验显示其存活率高于93%。2NETs的检测:在激光共聚焦显微镜下可观察到,共聚焦皿中的PMN周围生成绿色/红色网状或丝状的NETs。二、血清抑制NETs生成作用的再确认与成分筛选1标准PMN培养基体系中可以观察到NETs的大量生成,但在含10%FBS的PMN培养基体系中几乎观察不到NETs。上述结果表明,10%FBS对NETs的生成具有显著的抑制作用。2血浆成分的超滤:通过超滤离心获得超滤离心管下层滤液,该下层滤液即为含有不同分子量规格的血浆组分。3含有不同分子量规格的血浆组分对NETs作用的观察:3 kDa、30 kDa超滤离心管所得的血浆组分对NETs无明显作用,而50 kDa以上超滤离心管所得的血浆组份对NETs具有抑制作用,其中以100 kDa超滤离心管所得的血浆组份对NETs的抑制效果最强。上述结果表明,血浆中具有抑制NETs生成的成分,且可能为大分子量的物质。三、血液中具有抑制NETs生成作用的蛋白质成分的确认1血液中蛋白的选取:经过复习文献,血液中该分子量段中的常见和重要的蛋白分别为人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)、转脂蛋白 a-1(apolipoprotein Al,apoAl)、纤溶酶原(fibrinogen,FIB)、γ-球蛋白(γ-globulin)、转铁蛋白(transferrin,TRF)、IgG。鉴于蛋白质结构和保守性和获得的难易度,在本实验中牛血清白蛋白(bovine serum albumin,B SA)替代 HSA 进行实验。在上述蛋白的生理浓度范围中选取其中值作为实验工作浓度,浓度值分别为 40mg/ml(HSA/BSA)、3 mg/ml(HDL)、1.4mg/ml(apo A1)、22mg/ml(FIB)、17mg/ml(γ-globulin)、3mg/ml(TRF)、50 mg/ml(Ig G)。2血液中重要和常见的蛋白对NETs作用的观察:将实验蛋白的终浓度定为10%生理浓度的蛋白浓度,即4mg/mlHSA/BSA、0.3 mg/ml HDL、0.14 mg/ml apo A1、2.2 mg/ml FIB、1.7 mg/ml γ-globulin、0.3 mg/ml TRF、5mg/ml IgG),分别加入标准PMN培养基体系中检测NETs生成量。结果表明,10%实验生理浓度的HSA/BSA、HDL、FIB 对 NETs 有较强抑制作用,而 γ-globulin、apo A1、TRF、IgG 对NETs无明显抑制作用。3主要研究对象的选取:由于HSA在血液中含量最高且具有重要的生理意义,故选取HSA作为主要研究对象,但由于HSA价格昂贵,于是选取BSA替代进行后续相关实验。四、抑制NETs关键蛋白酶后白蛋白对NETs作用的研究1抑制MPO关键蛋白酶后白蛋白对NETs作用的研究:(1)在标准PMN培养基体系中NETs可大量生成,将MPO抑制剂加入标准培养基体系中NETs生成量略有降低,但仍有大量生成;(2)在低浓度BSA(0.5 mg/ml)的培养基体系中NETs仍可生成,MPO抑制剂加入含有低浓度BSA(0.5 mg/ml)的培养基体系中NETs生成量无明显变化;(3)较低浓度BSA(1.5 mg/ml)的PMN培养基体系中仍有少量NETs生成,将MPO抑制剂加入较低浓度BSA(1.5 mg/ml)的PMN培养基体系中后NETs生成量没有明显变化;(4)含BSA(4.5 mg/ml)的PMN培养基体系中仅有非常少量的NETs生成,将MPO抑制剂加入高浓度BSA(4.5mg/ml)的标准PMN培养基体系中则几乎不能观察到NETs生成。结果表明,加入MPO抑制剂后可减少NETs生成量,加入BSA后可加强对NETs的抑制,且抑制作用随着BSA浓度的增加而加强。2抑制NE关键蛋白酶后白蛋白对NETs作用的研究:(1)NE抑制剂加入标准PMN培养基体系中后NETs生成量略有降低,但仍有大量生成;(2)NE抑制剂加入含低浓度BSA(0.5mg/ml)的培养基体系中后,NETs虽有生成但生成量降低;(3)NE抑制剂加入较低浓度BSA(1.5 mg/ml)的培养基体系中后仅能观察到丝状NETs;(3)NE抑制剂加入高浓度BSA(4.5mg/ml)的标准PMN培养基体系中几乎不能观察到NETs生成。结果表明,NE抑制剂本身抑制NETs作用很低,但是可增强BSA抑制NETs的作用。上述实验说明加入NE抑制剂后可减少NETs生成量,加入BSA后可加强对NETs的抑制,且抑制作用随着BSA浓度的增加而加强。3抑制PAD4关键蛋白酶后白蛋白对NETs作用的研究:(1)PAD4抑制剂加入标准PMN培养基体系中NETs生成量略有降低,但仍有大量生成;(2)PAD4抑制剂加入含低浓度BSA(0.5 mg/ml)的培养基体系中,NETs虽有生成但生成量降低;(3)PAD4抑制剂加入较低浓度BSA(1.5 mg/ml)的培养基体系中仅能观察到丝状NETs;(4)PAD4抑制剂加入高浓度BSA(4.5 mg/ml)的标准PMN培养基体系中几乎不能观察到NETs生成。结果表明,PAD4抑制剂本身抑制NETs作用很低,但是可增强BSA抑制NETs的作用。上述实验说明在加入PAD4抑制剂后可减少NETs生成量,加入BSA后可加强对NETs的抑制,且抑制作用随着BSA浓度的增加而加强。五、抗人血清白蛋白抗体对白蛋白抑制NETs的影响1抗人血清白蛋白抗体与白蛋白的预孵:成功获得结合抗体的HSA。2抗人血清白蛋白抗体对白蛋白抑制NETs的影响:与抗体共同孵育后的BSA(结合抗体的BSA)加入PMN培养体系后,仍然可以观察到丝网状的NETs生成,表明结合抗体的BSA对NETs的抑制功能下降。六、氧化或还原状态的牛血清白蛋白的抗NETs作用1氧化状态BSA的制备:获得氧化状态的BSA。2还原状态的白蛋白的制备:获得氧化状态的BSA。3氧化或还原状态的BSA对NETs的影响:在含有氧化状态或还原状态的白蛋白(4 mg/ml)的标准PMN培养基体系中,NETs生成量均明显高于含正常BSA(4mg/ml)的标准PMN培养基体系。结果表明,改变白蛋白的氧化、还原状态会影响白蛋白对NETs的抑制作用。七、脂多糖和大肠埃希菌存在情况下牛血清白蛋白抑制NETs的作用1 LPS存在情况下BSA抑制NETs的作用1.1低浓度LPS存在情况下不同浓度BSA抑制NETs的作用1.1.1低浓度LPS存在情况下实验生理浓度BSA抑制NETs的作用:结果表明,实验生理浓度BSA环境中,LPS刺激PMN生成NETs受到明显抑制,升高LPS浓度会导致PMN大量死亡且有极少量丝状NETs生成。1.1.2高浓度LPS存在情况下不同浓度BSA抑制NETs的作用:实验结果表明,在高浓度BSA环境中即使有极高浓度LPS刺激,PMN也很难生成NETs;在低浓度BSA环境中,极高浓度LPS可弓起大量NETs生成。1.2 LPS存在情况下BSA与NETs生成的量效关系:NETs的生成量随着BSA浓度升高而降低,在含BSA(4.5mg/ml)PMN培养基体系中几乎不能观察到NETs生成。加入LPS的PMN培养基体系中NETs的生成量增多;但随着BSA浓度的升高,LPS诱导生成的NETs量逐渐减少。结果表明,BSA对LPS诱导的NETs抑制作用具有显著的量效关系。2 EC存在情况下BSA抑制NETs的作用2.1 EC存在情况下不同浓度BSA抑制NETs的作用2.1.1低浓度EC存在情况下BSA抑制NETs的作用:结果表明,实验生理浓度BSA环境中,加入EC也无NETs生成,而低浓度BSA环境中NETs变化不明显。2.1.2高浓度EC存在情况下不同浓度BSA抑制NETs的作用:实验结果显示,在未加入EC的PMN培养体系中,NETs的生成量随着BSA浓度增高而降低;加入了高浓度EC的PMN培养体系中,PMN直接死亡并不伴有NETs的生成。上述结果表明,在高浓度EC环境中,PMN直接死亡并不释放NETs。2.2 EC存在情况下BSA对NETs抑制的动态观察:结果显示,在低浓度BSA(4.5mg/ml)的环境中,无EC诱导的NETs随着时间的推移纤维样结构逐渐呈网状张开;NETs在EC诱导下的生成速率变化不明显,在60min时可观察到NETs纤维状结构更广,但在120 min时可观察到EC诱导的NETs纤维状结构局部则呈团状。上述结果表明EC对NETs的生成速率与生成量无明显作用,但可能会影响NETs纤维状结构的形态,推测可能与NETs捕捉细菌时需要变化形态有关。八、Ca2+浓度与Ca2+通道阻断剂对白蛋白抑制NETs作用的影响1 Ca2+浓度对白蛋白抑制NETs作用的影响1.1有Ca2+和无Ca2+培养基对NETs的生成的影响:含Ca2+的标准PMN培养基体系中NETs大量生成,而在无Ca2+的标准PMN培养基体系中NETs生成较少。结果表明,在无Ca2+的环境中PMN无法生成NETs,说明NETs的生成与Ca2+密切相关。1.2不同Ca2+浓度对NETs生成的影响:标准PMN培养基体系中Ca2+ 浓度为265mg/dl。在无Ca2+ 和含低浓度Ca2+(1.66mg/dl～3.31 mg/dl)的培养基体系中NETs的生成量显著减少,在Ca2+浓度高于6.62mg/dl的PMN培养基体系中NETs即可大量生成。结果表明,在一定的Ca2+浓度范围内,NETs的生成与Ca2+浓度呈正相关。2 Ca2+通道阻断剂对NETs生成的影响2.1维拉帕米对NETs生成的影响:标准PMN培养基体系中NETs可大量生成;在低浓度HSA(1.5 mg/ml)的标准培养基体系中有较多NETs的生成,将维拉帕米加入标准培养基体系中NETs生成降低,但仍有NETs生成。结果表明,维拉帕米可略微降低NETs生成量,NETs生成可能与钙离子通道相关。2.22-氨乙氧基二苯酯硼酸(2-APB)对白蛋白抑制NETs作用的影响:在标准PMN培养基体系中NETs可大量生成;在低浓度HSA(1.5mg/ml)的标准培养基体系中有较多NETs的生成;将2-APB加入含低浓度HSA(1.5mg/ml)的标准培养基体系中NETs的生成量无明显变化;在含HSA(4.5mg/ml)的标准培养基体系中几乎无NETs的生成,将2-APB加入含HSA(4.5 mg/ml)的标准培养基体系中NETs的生成量也无明显变化。结果表明,2-APB对NETs的生成无显著影响、对白蛋白抑制NETs的作用也无显著影响。九、不同血浆蛋白对中性粒细胞胞内总活性氧和线粒体活性氧水平的影响1BSA对PMN胞内总活性氧(ROS)水平的影响1.1 PMN胞内ROS水平的检测:标准PMN培养基体系中的PMN胞内产生大量ROS(1183429±136026),含10%BSA的标准PMN培养基体系中PMN胞内ROS水平较低(368608±12145)。1.2不同蛋白对PMN胞内ROS水平的影响:含HDL和apoAl的培养基体系中的PMN产生大量的ROS(HDL,1107035±179906;apoAl,1178918±114703)。上述结果表明,BSA/HSA可明显抑制PMN胞内ROS生成,而HDL、apoAl对PMN胞内ROS无明显作用。2 BSA对PMN胞内线粒体活性氧(mitoROS)水平的影响2.1 PMN胞内mitoROS水平的检测:标准PMN培养基体系中的PMN胞内产生大量mitoROS(20878±8270),含10%BSA的标准PMN培养基体系中PMN胞内ROS水平较低(6977±139)。2.2不同蛋白对PMN胞内mitoROS水平的影响:含BSA、HDL的PMN培养基体系中的PMN胞内mitoROS水平均有不同程度的降低。2.3线粒体呼吸链干扰剂对白蛋白抑制NETs生成作用的影响2.3.1线粒体呼吸链干扰剂对PMN胞内mitoROS水平的影响:抗霉素A可明显抑制PMN胞内mitoROS水平,鱼藤酮可以显著增加PMN胞内mitoROS水平.2.3.2线粒体呼吸链干扰剂对白蛋白抑制NETs生成作用的影响抗霉素A、鱼藤酮对NETs的生成均无明显影响,表明改变中性粒细胞胞内mitoROS水平与NETs的生成无明显关系。十、自噬干扰剂对白蛋白抑制NETs生成的影响1自噬激动剂对白蛋白抑制NETs作用的影响:将自噬激动剂雷帕霉素(RAPA)加入不含BSA和含有BSA(4.5 mg/ml)的标准PMN培养基体系中。结果显示,BSA可以抑制NETs的生成,但是RAPA可显著增加NETs的生成,并且RAPA可消除BSA对NETs生成的抑制作用。结果表明,BSA抑制NETs生成的作用与抑制自噬有关,增强自噬则可消除BSA的抑制NETs生成的作用。2自噬抑制剂对白蛋白抑制NETs作用的影响:将自噬抑制剂3-MA加入不含BSA和含有BSA(4.5 mg/ml)的标准PMN培养基体系中。结果显示,在上述培养体系中3-MA、BSA均可显著抑制NETs的生成,但是3-MA的加入并未显著改变BSA对NETs生成的抑制作用。结果再次表明,BSA抑制NETs生成的作用与抑制自噬有关,因此抑制自噬并不影响BSA的抑制NETs生成的作用。3 CaMKK抑制剂对NETs生成的影响:标准PMN培养基体系中NETs可大量生成;在含BSA(4mg/ml)的PMN培养基体系中NETs生成量明显减少;将CaMKK抑制剂STO609加入标准PMN培养基体系后NETs仍可大量生成。结果表明,STO609对NETs的生成无显著影响、对白蛋白抑制NETs的作用也无显著影响。结论1正常人血浆中存在具有抑制NETs生成的物质,其中常见且重要的蛋白质为白蛋白,其对NETs生成具有显著的抑制作用,而Ig G、γ-globulin、TRF、apo Al 对 NETs 无明显作用。2 LPS可诱导NETs的大量生成,EC可改变NETs的形态,在LPS、EC存在情况下,白蛋白可有效抑制NETs的生成。3胞外Ca2+浓度与NETs的生成密切相关,降低胞外Ca2+浓度可有效抑制NETs生成,非选择性Ca2+通道抑制剂维拉帕米可降低NETs生成量。4白蛋白抑制NETs生成的作用机制可能与其降低PMN胞内ROS和mitoROS水平、抑制自噬有关,与CaMKK通路无关系。