论文部分内容阅读
人类神经tau属于微管结合蛋白,具有促进微管蛋白组装和稳定微管系统的功能。最近的研究表明,tau是一种多功能蛋白,可以和肌动蛋白、DNA和RNA等分子相互作用;tau不仅具有使微管和肌动蛋白微丝成束的作用,而且还可以介导肌动蛋白微丝和微管的结合。为了进一步研究tau蛋白与肌动蛋白以及RNA的相互作用,本文作者分别采用PCR和megaprimerPCR方法构建了tau两个体系的突变。
MegaprimerPCR是进行基因突变的最简单和最灵活的方法。它通过两轮PCR(分别定义为PCR1和PCR2)实现对基因的插入、删除、替换和融合等操作。我们和其他研究组发现,对于某些突变,PCR2很容易实现,但对于另一些突变,PCR2的产量却很低。为了解决低产量的问题,通过对PCR2退火步骤的杂交体浓度的计算(按照二级动力学方程),使用MATLAB软件模拟了PCR2的产量。由此得到的结论为:(1)PCR2产量低的主要原因可能不是由于megaprimer的自退火所引起,而是由于megaprimer上的突变和其长度所造成;(2)通过调节引物和模板的浓度、两者的比例和延长PCR前几个循环的退火时间,可以有效提高PCR2的产量;(3)模拟表明PCR2的产量和循环数符合以下的关系:y=A2+(A1-A2)/[1+exp((nm)/x)],其中,A2表示PCR2的最大产量,A1是常数,m代表PCR2的扩增速度,是当产量为A2/2时所需PCR的循环数,n是PCR2的循环数。按照上述的分析和模拟,本文作者构建了带有删除和替换的tau23突变体。
通过低速沉降、电子显微镜和原子力显微镜的分析,作者研究了tau蛋白及其突变体对肌动蛋白的聚合和成束作用。结果表明,不仅tau的微管结合结构域(microtubule-bindingdomain,MTBD)可以促进肌动蛋白的聚合与成束,而且脯氨酸富集结构域(proline-richdomain,PRD)也具有同样的功能。同时发现tau蛋白与肌动蛋白的相互作用受到RNA的抑制。推测tau与肌动蛋白结合机制是静电相互作用,tau作为一种反离子使肌动蛋白微丝成束。
为了进一步研究RNA与tau蛋白的相互作用,通过凝胶阻滞的方法,得到以下结果:(1)RNA可以和人类tau23及tau40蛋白结合;(2)Tau与RNA的结合不仅抑制了tau促进肌动蛋白微丝成束,也抑制了tau促进微管组装的功能;(3)rRNA、tRNA和mRNA均可以和tau蛋白结合;(4)Tau通过脯氨酸富集结构域和微管结合结构域与RNA结合;(5)Tau蛋白可以和无结构小RNA(polyA30)及带有茎环结构的小RNA(polyA1sU15)结合;(6)这种结合受到NaCl的影响;(7)通过Ni-NTA亲和层析提纯的PRD和MTDB截短体蛋白均有RNA结合。因此,推测tau与RNA的结合也是通过静电的相互作用的方式进行的,这种结合是核苷酸序列非特异性的。