冠突散囊菌黑色素发酵工艺优化及理化性质研究

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天然黑色素主要来源于动物、植物和微生物,是已知存在最多分布最广的天然色素。为探究更多黑色素的功能和价值,本文围绕冠突散囊菌G1产黑色素发酵工艺、黑色素理化性质和黑色素组成展开研究,主要结论如下:(1)对茯砖茶中微生物进行分离,得到一株产黑色素的菌株G1,经形态学和ITS序列分析鉴定为冠突散囊菌,对菌株G1产黑色素条件进行探究。黑色素发酵液在200-800 nm波长范围内最大吸收波长扫描结果显示,其最大吸收波长为325 nm。以OD 325nm和菌丝干重为指标,选取六种单因素进行发酵工艺优化,单因素包括碳源、氮源、无机盐、初始pH、接种量和装液量。通过响应面试验进一步优化,得到最佳培养条件为胰蛋白胨0.65 g/50 mL、接种量4.6 mL/50 mL、发酵天数15 d,该条件下黑色素产量为0.12±0.031 g/50mL。(2)该黑色素不溶于1 mol/L盐酸(pH=1)、水、乙醇、甲醇、甲酸、乙腈和正己烷,可溶于1 mol/L氢氧化钠(pH=14)和二甲基亚砜,微溶于1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH=8)。黑色素在光照条件下较稳定,自然光和紫外光均能使黑色素溶液吸光度略微上升,而在黑暗环境中吸光度无明显变化。温度为40-80℃时,黑色素溶液吸光度随保温时间延长而呈上升趋势;当温度达到100℃,吸光度随保温时间延长呈下降趋势。黑色素溶液对Mn2+、Mg2+和K+较稳定,其中K+使黑色素溶液吸光度略微上升,Mn2+和Mg2+对黑色素溶液吸光度无明显影响;Cu2+和Fe2+使黑色素溶液产生沉淀,溶液吸光度随反应时间延长呈先上升后下降趋势。黑色素溶液对亚硫酸钠较稳定,吸光度无明显变化。黑色素溶液随过氧化氢浓度升高呈上升趋势,具有一定耐氧化性。所选四种添加剂中,黑色素溶液对蔗糖、氯化钠和苯甲酸钠具有较好稳定性,而抗坏血酸使黑色素溶液吸光度呈下降趋势。pH为3-1 1范围内黑色素溶液吸光度整体呈上升趋势,当溶液pH为3-5时,黑色素溶液吸光度随pH升高急剧上升;当溶液中pH为7-11时,黑色素溶液吸光度上升相对平缓。该黑色素的色价为175.5。(3)采用酸沉碱溶法对黑色素进行分离,并对结构进行分析。使用扫描电子显微镜观察到干燥的黑色素颗粒表面凹凸不平并具有裂痕,整体呈片状。紫外-可见光光谱显示黑色素在OD 325nm处有最大吸收峰。黑色素含有C、H、N和S,含量分别为61.44%、4.18%、1.05%和 0.1%。红外光谱中在 3412 cm-1、1602 cm-1、1465 cm-1、1374 cm-1、1257 cm-1、849 cm-1、768 cm-1和595 cm-1处有吸收峰,可能存在的结构有氨基或羟基、烷基、醚键和苯环或芳香环。(4)采用超滤管对去除菌丝的黑色素发酵液进行分离,得到四种组分UF-50、UF50-30、UF30-10和UF-10。通过紫外-可见光光谱检测,UF-50、UF50-30和UF30-10在OD 325nm处有最大吸收峰,UF-10在OD 280nm处有最大吸收峰。(5)采用Sephadex G-100对黑色素组分进行柱层析分离,从黑色素中分离得到组分GH-1和GH-2。通过紫外-可见光光谱检测,组分GH-1在OD 315nm处有最大吸收峰,而GH-2则无最大吸收峰。质谱结果表明组分GH-1分子量约为8000,组分GH-2分子量约为7700。组分GH-1的1H NMR结果显示在1.7 ppm、1.3 ppm和2.7 ppm附近处具有氢信号,推测结构中可能存在O-CH2-CH3、N-CH2-CH3或(C=O)-CH2-CH3和脂肪烃长链等结构;组分GH-2的1H NMR结果显示显示2.3 ppm、6.0 ppm和6.5-7.5 ppm附近处具有氢信号,推测结构可能存在苯环或芳香环、C=C、O-CH2-CH3、N-CH2-CH3 或(C=O)-CH2-CH3 等结构。
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