研究目的:甲状腺相关性眼病是是眼眶病中较常见的一种,且发病率逐渐上升,可引起外观及视功能的损伤,临床表现多样,疾病后果严重,具体发病原因不明确,故近年来一直是困扰眼科医生的难题。而吸烟被证明是甲状腺相关性眼病(TAO)的重要危险因素,另外,有研究发现吸烟与氧化应激存在相关性,而我们已知氧化应激在TAO的疾病过程中发挥着重要作用。香烟的成分十分复杂,其中公认的毒性成分为尼古丁,目前国内外在其他疾病方面针对吸烟的研究多采用香烟烟雾提取物(CSE)及尼古丁两种物质为刺激因素,眼眶成纤维细胞作为TAO的最终效应细胞,是近年来TAO相关研究的经典研究模型。故本研究采用原代培养的眼外肌来源眼眶成纤维细胞,研究香烟烟雾提取物及尼古丁作用于TAO患者及正常人眼眶成纤维细胞后,各种氧化应激指标ROS、MDA、8-OHdG的变化,探索香烟烟雾提取物及尼古丁在TAO这一疾病中是否通过氧化应激发挥作用,其具体的剂量关系,并通过检测香烟烟雾提取物及尼古丁对于眼眶成纤维细胞NF-kB通路的作用来进一步探索其可能的作用机制。方法:1、取TAO患者及正常人的眼外肌组织,因标本量少故采取组织块法进行原代培养,获得稳定传代的眼眶成纤维细胞,免疫组化的方法鉴定。2、用MTT法检测香烟烟雾提取物及尼古丁作用于眼眶成纤维细胞24小时及72小时后细胞的活性。3、ELISA法检测香烟烟雾提取物及尼古丁作用于眼眶成纤维细胞24小时及72小时后8-OHdG指标的变化。4、分光光度计法检测香烟烟雾提取物及尼古丁作用于眼眶成纤维细胞24小时及72小时后MDA指标的变化。5、酶标仪法检测香烟烟雾提取物及尼古丁作用于眼眶成纤维细胞24小时后ROS指标的变化6、RT-PCR法检测香烟烟雾提取物及尼古丁作用于眼眶成纤维细胞24小时后NF-kB相关基因的表达情况。结果:1、本实验成功通过组织块法原代培养眼外肌来源的成纤维细胞,能够稳定传代,且经过鉴定为眼眶成纤维细胞,能够成功建立细胞系后作为甲状腺相关性眼病的细胞模型,为后续试验提供可能。2、MTT检测结果显示24小时刺激,TAO患者眼眶成纤维细胞在CSE刺激下细胞活力下降幅度更大,而在72小时刺激条件下,低浓度和高浓度的尼古丁呈现了相似的杀伤性。可见吸烟的损伤作用随刺激时间的增强呈一定的累积作用。3、在24小时刺激条件下,尼古丁10ug/ml可显著升高两种细胞体内8-OHdG的含量;在72小时刺激条件下,CSE单独刺激和低浓度尼古丁即可引起8-OHdG产生的增加,可见高剂量的尼古丁可在短时间内即可促进8-OHdG含量的突然上升,而低剂量的尼古丁导致8-OHdG的缓慢积累。4、在同时给予CSE和尼古丁10ug/ml刺激之后,MDA含量相比CSE单独刺激以及阴性对照组均有显著的增加。在72小时刺激之后,观察细胞体内MDA含量变化,所有刺激条件对比阴性对照组MDA表达均有大幅度的增加。5、吸烟可通过增加ROS含量发挥作用。高浓度尼古丁的作用效果最明显。6、在TAO患者眼眶成纤维细胞中,CSE刺激之后NF-κB RNA水平显著性上调。可见吸烟通过上调NF-κB基因的表达发挥作用。结论:吸烟可导致眼眶成纤维细胞氧化应激指标MDA、8-OHdG及ROS增高,且尼古丁作为香烟中的主要毒性成分发挥作用,即使低浓度的尼古丁,也可随时间累积而发挥较强的作用,说明吸烟可通过引起氧化应激而参与TAO病理过程。其中可能的分子通路为NF-κB,吸烟可上调NF-κB基因的表达。