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微囊藻毒素(Microcystins, MCs)是一类由富营养化淡水蓝藻产生的单环七肽天然毒素。MC-LR是MCs家族中分布最广且毒性最强的一种异构体。随着世界水体污染日益加重,蓝藻水华的暴发日趋普遍,MCs污染已成为全球亟待关注的环境问题。近年来,我国生态系统退化,湖泊、水库水体富营养化呈现快速发展的趋势,在蓝藻水华的高发季,检测到我国太湖水域水体中MCs含量最高值达到54.897μg/L,约为WHO 1998年规定的安全限值1μg/L的55倍。研究证明MCs对肝、肾、神经系统、胃肠道等有毒性作用,本实验室通过急性动物实验,发现MC-LR对雌性生殖系统有很强的毒性作用,可造成卵巢重量下降,雌激素和孕酮水平下降,动情周期紊乱,各级卵泡数目发生变化,卵巢组织结构受损。因日常生活饮水是人群的主要暴露途径,而研究长期低剂量暴露MC-LR的影响来模拟自然环境中MCs的毒性效应是很有必要的,并且由于雌性生殖系统具有复杂的解剖结构和生殖周期,系统全面的MC-LR雌性生殖毒性研究鲜有报道。因此,本实验以小鼠为实验对象,以WHO规定生活饮用水中MC-LR限值1μ/L为参照,采取自然饮水的暴露方式进行长期低剂量染毒,研究MC-LR对雌性生殖功能的影响。另外,本实验室率先发现,MC-LR能进入卵巢组织,引起卵巢颗粒细胞凋亡,提示卵巢颗粒细胞是MC-LR雌性生殖毒性的重要靶细胞。基于此,我们以卵巢颗粒细胞为研究对象,通过体外实验来进一步探讨MC-LR雌性生殖毒性的作用机制。第一部分长时期低剂量暴露MC-LI对雌性小鼠生殖系统的影响一、目的通过体内实验,研究长期低剂量暴露MC-LR对雌性小鼠生殖系统的影响二、方法1、160只3周龄雌性BALB/c小鼠(10g左右)随机分为2大组：3个月组和6个月组,每个组分为4个小组：1个对照组和3个实验组,每组20只小鼠。实验组中,小鼠喂含MC-LR浓度分别为1μg/L、3.2gg/L和10μg/L的饮用水；对照组中,小鼠喂不含MC-LR的正常饮用水。分别饲养3个月和6个月后,均在小鼠动情前期处理,眼球取血,而后断颈处死,取卵巢等脏器备用。2、常规方法称小鼠体重、卵巢湿重和饮水量；阴道涂片观察小鼠动情周期的变化；酶联免疫吸附测定血清中生殖内分泌激素：雌激素(Estradiol, E2)和孕激素(Progesterone, P4)水平,放免法检测黄体生成素(Luteinizing Hormone,LH)和卵泡刺激素(Follicle Stimulating Hormone, FSH)的水平；制作卵巢石蜡切片,连续切片并H&E染色,光学显微镜下拍照,计数各级卵泡的变化；TUNEL检测卵巢组织凋亡情况；繁殖实验观察小鼠产仔情况。三、结果1, MC-LR染毒3个月组,实验组与对照组相比体重净增长量、饮水量、LH和产仔率没有明显变化,P4水平上升趋势极显著(P<0.01)且有时间-剂量依赖效应；卵巢闭锁卵泡数目显著上升趋势(P<0.05)；MC-LR 10μg/L组小鼠血清E2水平呈现下降趋势,卵巢系数显著降低(P<0.05)、FSH水平显著上升(P<0.05)；3.2μgL和10μg/L组小鼠产仔死亡率、动情间期时长呈上升趋势,动情期时长显著减少(P<0.05),动情后期时长显著增加(P<0.05)；TUNEL检测发现高浓度组卵巢组织凋亡略有增加。2, MC-LR染毒6个月组,实验组与对照组相比体重净增长量、饮水量没有明显变化,卵巢系数、动情期时长、产仔率降低趋势显著(P<0.05),动情间期时长、闭锁卵泡上升趋势显著(P<0.05)；MC-LR 10μg/L组FSH水平、产仔死亡率显著上升(P<0.05),P4水平极显著上升(P<0.01)；3.2μg/L组LH水平显著上升(P<0.05)；10 μg/L和3.2 μg/L组E2水平显著下降(P<0.05)；TUNEL检测发现3.2μg/L和10μg/L组卵巢组织凋亡显著增加(P<0.05)。四、结论1、长时期低剂量自然饮水染毒MC-LI对雌性小鼠基本生理指标没有显著影响。2、MC-LR可使卵巢组织重量减轻,即MC-LR可能影响卵巢组织的生长发育。3、MC-LR能引起卵巢组织闭锁卵泡显著增加。4、MC-LR能干扰雌激素和孕激素的合成,降低小鼠血清E2水平,升高P4水平。5、MC-LR能引起雌性小鼠动情周期紊乱,使动情期缩短,动情后期和动情间期延长,进而延长动情周期时长。6、MC-LR能引起雌性小鼠产仔率降低,鼠仔死亡率增加。7、MC-LR可使卵巢组织结构损坏,导致细胞凋亡增加。第二部分MC-LR对原代培养的小鼠卵巢颗粒细胞的毒性作用一、目的通过体外实验,研究MC-LR对卵巢颗粒细胞的毒性作用,初步探讨MC-LR对雌性生殖系统的毒性作用机制。二、方法1、改良颗粒细胞提取方法,在解剖显微镜下取21天BALB/c小鼠卵巢,并用lml注射器机械法刺破卵泡,反复轻轻吹打,过滤得到卵巢颗粒细胞。培养24h后,换液,继续培养48h后即得到纯度较高的卵巢颗粒细胞。2、形态学观察,在倒置相差显微镜下观察颗粒细胞的生长行为和形态特征。3、利用CCK-8法绘制颗粒细胞的增殖曲线。4、利用免疫荧光法鉴定卵巢颗粒细胞的纯度。5、卵巢颗粒细胞分为5个MC-LR浓度组检测各项指标,即0、0.05μM、0.5μM、5μM、50 μM。6、利用免疫荧光法检测MC-LR是否进入卵巢颗粒细胞。7、利用MTT法检测细胞活力,MDA、CAT、SOD试剂盒检测MC-LR对细胞氧化应激的影响,LDH试剂盒来检测MC-LR对细胞膜完整性的影响。8、采用Annexin V/PI双染色法和TUNEL法检测MC-LR对颗粒细胞凋亡的影响。三、结果1、倒置相差显微镜观察结果表明,刚分离的卵巢颗粒细胞为球形,大小均一。12h细胞开始贴壁,细胞较小,24h后细胞形态不规则,呈梭形或多角形,有聚集生长的现象。72h颗粒细胞可完全铺满皿底,形成单层颗粒细胞。2、通过检测细胞增殖实验发现颗粒细胞在培养初期随着培养时间的延长而增殖,24 h和48h时OD值不断增高,72 h时细胞生长极度旺盛,OD值达到峰值。3、通过免疫荧光法发现所得卵巢颗粒细胞纯度较高,且MC-LR能进入卵巢颗粒细胞。4、MTT法检测细胞活力发现：染毒MC-LR24h后,细胞活力在5μM显著降低(P<0.05),在50μM极显著降低(P<0.01)；染毒MC-LR48h后,颗粒细胞活力在5gM和50μM极显著降低(P<0.01)。5、MDA、CAT、SOD试剂盒检测MC-LR对细胞氧化压力毒性影响发现：染毒MC-LR24h后,MDA水平在实验组(0.05、0.5、5、50μM)均显著升高(P<0.05)；染毒MC-LR 48h后,MDA水平在0.5gM显著升高(P<0.05),在5gM和50μM极显著升高(P<0.01)。染毒MC-LR24h后,SOD水平先升高后降低,在0.05μM显著升高(P<0.05),在50μM极显著降低(P<0.01)；染毒MC-LR48h后,SOD水平在0.5μM显著降低(P<0.05),在5μM和50μM极显著降低(P<0.01)。染毒MC-LR 24h后,CAT水平在50μM显著降低(P<0.05)；染毒MC-LR48 h后,CAT水平在5μM和50μM显著降低(P<0.05)。6、LDH试剂盒来检测MC-LR对细胞膜完整性的毒性影响发现：染毒MC-LR24h后,LDH释放率有升高的趋势,与对照组相比没有显著差异；染毒MC-LR48 h后,LDH释放率在实验组(0.05、0.5、5、50μM)均显著升高(P<0.05)。7、Annexin V/PI结果显示染毒MC-LR24h后,细胞的凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)有升高的趋势,在50μM显著升高(P<0.05)。8、TUNEL结果显示染毒MC-LR24h后细胞凋亡率在0.5μM显著升高(P<0.05),在5μM和50μ.M极显著升高(P<0.01)：染毒MC-LR 48h后细胞凋亡率在实验组(0.05、0.5、5、50μM)均极显著升高(P<0.01)。四、结论1、在体外培养的条件下,能获得高纯度的卵巢颗粒细胞。2、MC-LR能够进入卵巢颗粒细胞。3、MC-LR能使卵巢颗粒细胞活力下降。4、MC-LR能诱导卵巢颗粒细胞产生氧化应激,导致细胞氧化损伤,破坏细胞膜的完整性,最终导致细胞凋亡。