研究背景肺癌是全世界癌症相关死亡的最常见原因,其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌总数的80-85%,其以发病率较高、转移率高、复发率高的特点严重影响人类的健康。在过去的二十年中,非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗取得了重要进展,增加了我们对疾病生物学和肿瘤进展机制的了解,并促进了早期发现和多模式护理。但是NSCLC的总体治愈率和生存率仍然很低,尤其是晚期或转移性的患者。近年来,免疫检查点抑制剂(ICIs)的发展为晚期或转移性非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)的治疗带来了希望,临床研究表明非小细胞肺癌在PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制剂的治疗中有着良好的结果.免疫检查点抑制剂是一种目前备受重视的免疫疗法,它改变了许多癌症的治疗方式。免疫检查点抑制剂通常通过单用或联用抗体阻断细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T lymphocyte-associated protein 4,CTLA-4)或程序性细胞死亡因子 1(programmed cell death 1,PD-1)来实现。程序性细胞死亡配体1(PD-L1)是表达于肿瘤细胞和肿瘤浸润性免疫细胞上的一种免疫检查点蛋白,PD-L1与PD-1的结合在许多方面改变了 T细胞的活性,抑制了 T细胞的增殖、存活、细胞因子的产生和其他效应功能。PD-L1在多种细胞类型的表面表达,包括巨噬细胞、树突状细胞和内皮细胞。某些致癌信号可以驱动PD-L1在肿瘤细胞表面表达,促进肿瘤的免疫逃逸。有研究表明PD-L1翻译后修饰对其表达和功能起着有效的调控作用,如泛素化、磷酸化、糖基化和棕榈酰化等。靶向PD-L1翻译后修饰的策略在激活抗肿瘤免疫方面取得了重要进展,特别是通过泛素化修饰。蛋白质的泛素化修饰主要是通过三种泛素相关酶进行的:E1泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme)、E2泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme)和 E3 泛素连接酶(ubiquitinprotein ligase)。其中E3泛素连接酶在其修饰过程中起着重要的作用,通过E3泛素连接酶可将泛素分子精确偶联到靶蛋白分子上,实现对靶蛋白分子的特异性修饰。蛋白质泛素化修饰的过程是可逆的,其逆过程去泛素化可以通过去泛素化酶(DUBs)维持蛋白质稳定性。去泛素化酶可以逆转泛素连接酶催化的修饰,使靶蛋白上的赖氨酸残基和泛素分子C末端上的肽键裂解,从而使E3泛素连接酶的功能受到阻断,使底物蛋白与泛素链的连接受阻,发挥去泛素化的作用,因此被认为是多种细胞过程的重要调节因子。去泛素化酶家族中的泛素羧基末端水解酶UCHL1是一种新型的去泛素化酶,具有清除泛素化蛋白中泛素的功能,防止泛素化蛋白被蛋白酶体靶向降解。有研究表明该基因在原发性肺癌和肺癌细胞系中高表达,而在正常肺组织中不表达。那么UCHL1是否可以影响NSCLC细胞表面PD-L1分子的表达?如果影响了其表达是否会影响T细胞对肿瘤细胞的杀伤功能?这种影响是通过何种途径产生的?这是本课题研究的主要目的。研究目的针对上述问题,主要探究去泛素化酶UCHL1对NSCLC细胞表面PD-L1分子表达影响及作用机制。研究方法及结果(一)UCHL1调控PD-L1的表达1.UCHL1促进PD-L1的蛋白表达(1)在NSCLC细胞中,沉默UCHL1的表达可抑制PD-L1蛋白的表达首先合成UCHL1的小干扰RNA,并在NCI-H460细胞系中进行基因沉默实验。收取转入siNC或siUCHL1的细胞,通过流式细胞术和Western Blot检测PD-L1分子在蛋白水平上的变化。实验结果显示沉默UCHL1可以在蛋白水平降低PD-L1的表达。(2)在NSCLC细胞中,UCHL1过表达可促进PD-L1蛋白的表达首先在pRK5空载上构建pRK5-UCHL1-Flag质粒,并在A549细胞系中进行过表达。收取转入pRK5或pRK5-UCHL1-Flag的细胞,通过流式细胞术和Western Blot检测PD-L1分子在蛋白水平上的变化。实验结果显示过表达UCHL1可以在蛋白水平上使PD-L1分子高表达。(3)在NSCLC细胞中,UCHL1的抑制剂可抑制PD-L1的蛋白表达使用UCHL1的抑制剂LDN-57444,在NCI-H460细胞系中抑制UCHL1的表达。在NCI-H460中加入UCHL1的抑制剂,通过流式细胞术和Western Blot检测PD-L1分子在蛋白水平上的变化。实验结果显示采用抑制剂抑制UCHL1的活性后PD-L1分子的蛋白水平有明显降低趋势。2.UCHL1对PD-L1表达的调控作用发生在基因水平(1)UCHL1 促进 PD-L1 mRNA 的表达NCI-H460细胞系中进行小干扰RNA实验,先在细胞中转入siNC或siUCHL1,24h后收取siNC或siUCHL1细胞的RNA,并进行逆转录合成cDNA,使用RT-PCR的方法鉴定在mRNA水平UCHL1对PD-L1的影响,实验结果显示UCHL1的表达下调在mRNA水平可以使PD-L1分子低表达。在A549细胞系进行UCHL1过表达实验,先转染过表达质粒,24h后收取pRK5或pRK5-UCHL1-Flag细胞的RNA,并进行逆转录合成cDNA,使用RT-PCR的方法鉴定在mRNA水平UCHL1对PD-L1的影响,实验结果显示UCHL1的过表达在mRNA水平可以使PD-L1分子高表达。在NCI-H460细胞中加入UCHL1的抑制剂,24h后收取RNA,并进行逆转录合成cDNA,使用RT-PCR的方法鉴定在mRNA水平UCHL1对PD-L1的影响,实验结果显示UCHL1的抑制剂在mRNA水平可以使PD-L1分子低表达。(2)UCHL1促进PD-L1基因的转录本实验室构建了含有PD-L1基因启动区的质粒pGL3-PD-L1。在NCI-H460细胞中转染siUCHL1,24h后分别转染质粒pGL3-Basic+pRL-TK(20:1)和pGL3-PD-L1+pRL-TK(20:1),24h后裂解细胞收取上清,双荧光素酶报告基因检测PD-L1基因启动区的活性,结果表明沉默UCHL1表达导致PD-L1基因的转录活性下降。在A549细胞中转染pRK5-UCHL1质粒,24h后分别转染质粒pGL3-Basic+pRL-TK(20:1)和pGL3-PD-L1+pRL-TK(20:1),24h后裂解细胞收取上清,双荧光素酶报告基因检测PD-L1启动区的活性,结果表明UCHL1过表达导致PD-L1基因的转录活性升高。3.UCHL1和PD-L1在人非小细胞肺癌组织中表达相关性分析我们从上海芯超生物科技有限公司购买了两张连续切片的人非小细胞肺癌组织芯片,其中一张采用UCHL1抗体染色,另一张进行PD-L1抗体染色,实验结果显示UCHL1在肺小细胞肺癌组织中的阳性率为60%,且其表达呈异质性。即同一组织两张连续切片,待染色完成后,使用显微镜高倍镜观察并拍照。结果显示,UCHL1表达较高的癌组织局部PD-L1表达较强,具有相关性趋势。但是通过统计并无明显的统计学意义,所以我们准备扩大标本量再进一步进行论证。(二)UCHL1调控PD-L1的功能1.刺激Jurkat细胞表达PD-1分子我们采用PHA诱导Jurkat细胞,使其表达PD-1分子。通过流式细胞术检测确定使PD-1表达最高的PHA的浓度为10ug/ml。2.UCHL1高表达的NSCLC细胞可以抑制表达PD-1的Jurkat细胞的活性将PHA诱导后的Jurkat细胞与NSCLC细胞在U型96孔板中进行共培,同时加上CD3/CD28抗体使Jurkat细胞活化,48h后通过ELISA检测培养上清中的IL-2的水平。首先确定Jurkat细胞与NSCLC细胞共培的最适比例。结果表明,在两者比例为1:1的时候,H460细胞可以抑制Jurkat细胞的活性。Jurkat细胞与H460(沉默UCHL1)共培,结果表明UCHL1低表达的NSCLC细胞不会减弱Jurkat细胞的活性。Jurkat细胞与A549(过表达UCHL1)或A549(过表达UCHL1同时沉默PD-L1)共培,结果表明UCHL1高表达的NSCLC细胞可以抑制Jurkat细胞的活性,并且这种抑制作用依赖肿瘤细胞表达PD-L1分子。(三)UCHL1调控PD-L1表达的分子机制1.明确在NSCLC细胞中影响PD-L1表达的信号通路通过文献查阅,我们发现影响PD-L1表达的信号通路主要有:NF-κ B、STAT1、STAT3、ERK 以及 PI3K/AKT 通路。首先我们合成P65、STAT1、STAT3及AKT的小干扰RNA,然后将siP65、siSTAT1、siSTAT3及siAKT分别转入NCI-H460细胞中。24h后收取其RNA,并进行逆转录合成cDNA,使用RT-PCR的方法检测PD-L1的mRNA表达情况,同时在48h后通过Western Blot检测PD-L1蛋白表达情况。实验结果显示转录因子STAT1、STAT3和ERK沉默后,在mRNA和蛋白水平对PD-L1分子表达的影响并不显著。但是采用siP65和siAKT抑制相关信号通路NF-κ B和PI3K/AKT,可显著降低PD-L1在mRNA和蛋白水平的表达。2.NSCLC细胞中UCHL1通过NF-κB通路调控PD-L1的表达(1)在NSCLC细胞中UCHL1促进P65信号通路活化在NCI-H460细胞中转入siUCHL1,48小时后收蛋白,Western Blot检测转录因子P65 Ser536位点的磷酸化水平,结果表明UCHL1表达下调可导致P65磷酸化水平下降。在A549细胞内转染pRK5-UCHL1质粒,48小时后收蛋白,Western Blot检测转录因子P65 Ser536位点的磷酸化水平,结果表明UCHL1的高表达可使转录因子P65磷酸化水平升高。在NCI-H460细胞培养体系中加入UCHL1的抑制剂LDN-57444(10uM),持续抑制48小时后收蛋白,Western Blot检测转录因子P65 Ser536位点的磷酸化水平,结果表明抑制UCHL1功能可导致P65的磷酸化水平降低。(2)UCHL1通过P65信号通路促进PD-L1的表达在A549细胞中转染pRK5或pRK5-UCHL1质粒,24h后分别转染质粒pGL3-PD-L1+pRL-TK(20:1)和pGL3-PD-L1-MutP65+pRL-TK(20:1),24h后裂解细胞收取上清,双荧光素酶报告基因检测PD-L1启动区的活性.结果表明UCHL1过表达增加了 PD-L1启动子区域的活性,但没有增加P65结合位点突变的PD-L1启动子区域的活性。在A549细胞中过表达UCHL1同时沉默P65,进行挽救实验,48h后收取细胞通过Western Blot检测PD-L1分子在蛋白水平上的变化。结果表明UCHL1的过表达促进了 PD-L1的表达,但同时沉默P65减弱了 PD-L1的上调。3.在NSCLC细胞中UCHL1通过AKT-P65信号轴促进PD-L1表达(1)在NSCLC细胞中UCHL1可以促进AKT信号通路活化在NCI-H460细胞中转入siUCHL1,48小时后收蛋白,Western Blot检测转录因子AKT Ser473位点的磷酸化水平,结果表明UCHL1表达下调可导致AKT活化降低。在A549细胞内转染pRK5-UCHL1质粒,48小时后收蛋白,Western Blot检测转录因子AKTSer473位点的磷酸化水平,结果表明UCHL1的高表达可使转录因子AKT活化升高。在NCI-H460细胞培养体系中加入UCHL1的抑制剂LDN-57444(10uM),持续抑制48小时后收蛋白,Western Blot检测转录因子AKT Ser473位点的磷酸化水平,结果表明抑制UCHL1功能可导致AKT活化降低。(2)UCHL1通过AKT信号通路促进PD-L1的表达在A549细胞中过表达UCHL1同时沉默AKT,进行挽救实验,24h后收取其RNA,并进行逆转录合成cDNA,使用RT-PCR的方法鉴定在mRNA水平对PD-L1的影响,同时在48h后收取细胞通过Western Blot检测PD-L1分子在蛋白水平上的变化。结果表明UCHL1的过表达促进了 PD-L1的表达,但同时沉默AKT减弱了 PD-L1表达的上调。(3)UCHL1通过AKT-P65信号轴促进PD-L1表达在NCI-H460细胞中转入siAKT,48小时后收蛋白,Western Blot检测转录因子P65 Ser536位点的磷酸化水平,结果表明AKT表达下调可导致P65活化降低。在A549细胞中同时转染AKT质粒并沉默P65,24h后收取其RNA,并进行逆转录合成cDNA,使用RT-PCR的方法鉴定在mRNA水平对PD-L1的影响,同时在48h后收取细胞通过Western Blot检测PD-L1分子在蛋白水平上的变化以及P65和AKT的磷酸化情况。结果表明转入质粒AKT后,AKT的活化水平升高,PD-L1的表达升高;同时转入质粒AKT和siP65,则PD-L1的表达下调,说明AKT促进PD-L1的表达依赖NF-κB信号通路。4.UCHL1通过增强子调控PD-L1的表达(1)增强子的选取及构建通过生物信息学分析和文献报道明确PD-L1基因在染色体的位置(chr9:5,450,503-5,470,567)。我们在UCSC网站分析可能被P65调控的PD-L1基因转录区域主要有以下六个(Chr9:5,586,200-5,587,000)、(Chr9:5,459,189-5,459818)、(Chr9:5479406-5480560)、(Chr9:5,493,000-5,494,000)、(Chr9:5,478,000-5,479,000)、(Chr9:5582885-5583869),我们分别给其命名为A、B、C、D、E、F。我们将其构建在PGL3-Promoter载体上,分别命名为pGL3-Promoter-A、pGL3-Promoter-B、pGL3-Promoter-C、pGL3-Promoter-D、pGL3-Promoter-E、pGL3-Promoter-F.(2)检测增强子对PD-L1的调控首先在293T细胞中检测增强子的活性,转入上述重组质粒,进行双荧光素酶报告基因实验,结果显示增强子C、增强子E和增强子F有活性,并受到转录因子P65的调控;然后在NCI-H460细胞中转染siUCHL1和siP65,同时转染质粒pGL3-Promoter+pRL-TK(20:1)和pGL3-Promoter-C(F)+pRL-TK(20:1),24h后裂解细胞收取上清,采用双荧光素酶报告基因实验检测增强子活性,我们发现NSCLC细胞中UCHL1可调控Enhancer-C和Enhancer-F的增强子活性,这提示UCHL1可通过影响增强子的活性促进PD-L1的表达.结论1.在NSCLC细胞中去泛素化酶UCHL1可以促进PD-L1的表达;2.在NSCLC细胞中UCHL1通过促进PD-L1的表达抑制Jurkat细胞的活性;3.UCHL1通过AKT-P65信号通路轴促进PD-L1的表达;4.UCHL1可通过影响增强子的活性促进PD-L1的表达。创新点及意义1.本课题首次证实了在非小细胞肺癌中UCHL1调控PD-L1的表达.本研究结果显示,UCHL1主要通过AKT-P65信号轴来调控PD-L1的表达。2.本课题的研究结果揭示了在非小细胞肺癌中UCHL1对PD-L1分子的调控机制,预示着UCHL1可能成为非小细胞肺癌的治疗靶点,为防止非小细胞肺癌的肿瘤免疫逃逸提供了新途径。