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[目的]
通过研究整合子系统及β-内酰胺酶基因在铜绿假单胞菌临床分离株中的分布及其在该菌耐药中的作用,从基因水平探讨铜绿假单胞菌的耐药机制;分析铜绿假单胞菌Ⅰ类整合子整合酶基因与群体感应系统调控基因的相关性,初步探讨Ⅰ类整合子的调控机制。
[方法]
1.采用纸片扩散法检测81株临床分离的铜绿假单胞菌对12种常用抗生素的敏感性,了解该菌的耐药情况。
2.采用多重PCR方法检测Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类整合子在铜绿假单胞菌临床分离株中的分布,并对整合子可变区进行基因扩增、测序及比对分析,以明确其所携带的基因盒类型;探讨整合子系统在铜绿假单胞菌耐药性中的作用。
3.采用PCR方法检测β-内酰胺酶基因(KPC-2、TEM、SHV、NDM、VIM、IMP)在23株多重耐药铜绿假单胞菌中的分布,并对相应基因进行测序分析,探讨β-内酰胺酶基因在该菌多重耐药性中的作用。
4.以亚抑菌浓度的阿奇霉素干扰铜绿假单胞菌群体感应系统,采用荧光定量RT-PCR方法检测铜绿假单胞菌的Ⅰ类整合子整合酶基因(intI1)与群体感应系统基因(LasR、RhlI、RhlR)的mRNA表达水平,分析前者与后者的相关性;初步探讨Ⅰ类整合子是否受群体感应系统的调控。
[结果]
1.81株铜绿假单胞菌对所选12种抗生素的耐药率依次为:庆大霉素45.7%,左旋氧氟沙星42%,氨曲南39.5%,环丙沙星33.3%,哌拉西林和哌拉西林/他唑巴坦28.4%,头孢他啶26%,阿米卡星和头孢吡肟21%,亚胺培南19.8%,妥布霉素13.6%,美罗培南11.1%;其中23株(28.2%)铜绿假单胞菌对上述12种抗生素表现为多重耐药。
2.81株铜绿假单胞菌中,有30株(37%)携带Ⅰ类整合子,未发现Ⅱ类、Ⅲ类整合子;在30株Ⅰ类整合子阳性菌中检测到19株(63.3%)携带整合子相关基因盒,基因盒的类型及排列方式如下:aadA4a(9株)、aacA4-catB8-aadA1(3株)、aac(6)-lai-orfv-aadA1-qacEΔ1-sul(2株)、blaIMP-6-qac-aacA4-OXA-1-aadA1-qacEΔ1-sul(3株)。另外有2株菌携带的不是耐药基因盒,而是编码ABC转运系统蛋白和噬菌体蛋白的基因。
3.23株多重耐药铜绿假单胞菌中,有14株(60.9%)携带β-内酰胺酶相关基因,其中5株携带TEM-1基因,3株携带SHV-5a基因,3株携带IMP-1基因,2株携带VIM-2基因,1株携带NDM-1基因;而针对KPC-2基因的扩增,有2株菌PCR产物阳性,测序比对与GeneBank登录号AP012280.1的序列相似度高达98%,后者是高度耐受碳青霉烯类的Pseudomonas aeruginosa NCGM2.S1菌的一段序列,但是未能确定与KPC型基因的关系。
4.在亚抑菌浓度的阿奇霉素作用下,铜绿假单胞菌群体感应系统的三个调控基因LasR、RhlI、RhlR均有不同程度的下降,并且表现出了剂量依赖关系;检测铜绿假单胞菌的Ⅰ类整合酶基因,发现随着阿奇霉素浓度的增高,其intI1mRNA表达量总体呈现下降趋势,与LasR、RhlI、 RhlR三个基因的mRNA表达水平比较,前者与后者呈现了正相关。
[结论]
1.81株铜绿假单胞菌临床分离株中,有23株表现为多重耐药。
2.Ⅰ类整合子及相关耐药基因盒在铜绿假单胞菌临床分离株中广泛分布,Ⅰ类整合子阳性菌株的耐药率明显高于阴性株的,提示整合子系统与该菌的耐药性密切相关;Ⅰ类整合子携带的基因盒以氨基糖苷类修饰酶基因为主;在铜绿假单胞菌Ⅰ类整合子中检测出了携带blaIMP-6-qac-aacA4-OXA-1-aadA1-qacEΔ1-sul;并发现2株菌Ⅰ类整合子携带编码ABC转运系统蛋白和噬菌体蛋白的基因,它们是否参与细菌耐药,还有待进一步研究。
3.TEM、SHV、VIM、IMP型的β-内酰胺酶基因在多重耐药铜绿假单胞菌中分布较为广泛;在该菌中检测出NDM-1基因,国内尚属首例。
4.铜绿假单胞菌群体感应系统抑制剂阿奇霉素可影响Ⅰ类整合子整合酶基因的mRNA的表达,提示Ⅰ类整合子可能受群体感应系统的调控。