目的褪黑素是一种胺类激素。除松果体外,其他一些器官也能合成褪黑素,例如胃肠道、视网膜和骨髓。老鼠和人类的骨髓细胞有从头合成褪黑素的能力,其中,老鼠骨髓褪黑素的浓度大约是外周血浓度的2倍。IS是指在没有潜在的椎体异常或明显的生理缺陷的情况下发生的脊柱的3D旋转。一些研究发现,高浓度褪黑素可以抑制实验性IS的发展;临床应用褪黑素也能阻止部分褪黑素水平低下的IS病人畸形进展。实验证实:低浓度褪黑素作用于成骨细胞褪黑素受体,促进成骨细胞的增殖。而当褪黑素浓度增加,达到比较高的浓度时,则导致细胞内钙超载,引起内质网应激,通过抑制内质网上Bcl-2通路,诱导成骨细胞凋亡。而细胞的凋亡行为,与自噬密切相关。自噬行为是真核细胞修复和降解受损大分子蛋白和细胞器的重要代谢过程。并且,自噬在消除衰老细胞器、结构错误的蛋白质和受损的分子、回收有限的营养素和氧气中发挥着管家作用。有的时候,自噬对细胞起到了一种应激保护作用从而抑制了细胞凋亡。而在另一种情况下,自噬构成了一种细胞程序性死亡的替代途径。长链非编码RNA(lnc RNA)是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA,近几年发现其参与细胞的自噬过程,通过RNA-RNA、RNA-DNA等多种作用方式发挥调控功能。微小RNA(mi RNA)是一类长度为20-23个核苷酸的小非编码内源性RNA,可以负向调节转录后蛋白编码的表达;通过特异性靶向3’-非翻译区(3’-UTR)与多细胞真核m RNA结合,在各种生物活动,如细胞的增殖、分化和凋亡中发挥重要调节作用。由于Lnc RNA在结构等方面有着类似m RNA的特点,所以也可以被mi RNA所调控。lnc RNA与mi RNA的相互作用是近几年的研究热点。褪黑素诱导的成骨细胞的自噬的机制尚不明确。更进一步的,lnc RNA与mi RNA相互作用调控褪黑素诱导的成骨细胞自噬的机制,也未曾见有研究发表。因此,本课题主要深入研究lnc RNA-MALAT1与mi RNA-200b调控褪黑素诱导的成骨细胞自噬的机制的研究。研究方法第一部分:为研究高浓度褪黑素作用于人成骨细胞系(h FOB1.19),对自噬行为产生的影响,利用WESTERN BLOT法检测自噬相关蛋白、利用免疫荧光技术观察细胞自噬体的形成;为检测高浓度褪黑素对成骨细胞细胞活力的影响,利用cck-8技术检测处理后细胞的活性;然后,利用RT-q PCR技术,检测高浓度褪黑素诱导的成骨细胞中MALAT1、mi R-200b的表达水平。第二部分:利用生物信息学预测mi R-200b与MALAT1之间的标靶关系,并检测嫌疑序列;然后利用双荧光素酶报告基因技术,将结合位点周围序列构建在报告基因载体上,验证结合位点是否切实可信。第三部分:利用瞬时转染技术,构建基于人成骨细胞系(h FOB1.19)的mi R-200b的过表达和抑制模型;然后利用RT-q PCR技术,研究mi R-200b与MALAT1的调控关系;最后利用WESTERN BLOT技术,研究mi R-200b与MALAT1对成骨细胞自噬行为的影响。结果cck-8实验显示,高浓度褪黑素对成骨细胞产生增殖抑制的效应。Western blot和免疫荧光证明,高浓度褪黑素使成骨细胞自噬水平升高。RT-q PCR结果表明,高浓度褪黑素诱导的成骨细胞中,MALAT1呈高表达而mi R-200b呈低表达,二者呈相反关系。生物信息学分析显示MALAT1的3’UTR存在mi R-200b的结合位点,共计3个嫌疑序列。双荧光素酶报告基因结果证实mi R-200b可以通过结合位点抑制MALAT1的表达,MALAT1是mi R-200b的直接靶基因。将分别转染了mi R-200b mimics和mi R-200b inhibitor的成骨细胞用于RT-q PCR检测,结果显示,过表达mi R-200b时,MALAT1呈低表达,抑制mi R-200b时,结果相反。Western blot结果显示,抑制mi R-200b时,成骨细胞自噬增强,抑制mi R-200b时,结果相反。结论1.高浓度褪黑素,能激活成骨细胞自噬,并降低mi R-200b的表达、提高MALAT1的表达。2.mi R-200b直接靶向作用于MALAT1。3.抑制mi R-200b能提高MALAT1的表达,并增强成骨细胞自噬。