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豆科植物根系释放的酚类黄酮化合物进入根际,激活根瘤菌结瘤基因的表达,导致产生和分泌结瘤因子(NF)。结瘤因子是根瘤菌与豆科植物相互识别的关键信号分子,在共生信号途径中有重要作用。对典型的模式豆科植物苜蓿和百脉根根瘤的基因组分析表明,信号途径是结瘤信号转导所必须的。研究表明,两个GRAS家族转录调节因子—结瘤信号通道蛋白(NSP1)和NSP2,一起参与CCa MK下游共生固氮途径的调控。在体外,NSP1可直接与早期结瘤素基因ENOD11、ERN1和NIN的启动子部位结合,表明这些基因的表达需要NSP1。在植物体内,NSP1与ENOD11启动子的相互作用还需要NSP2,即NSP1与NSP2形成异源二聚体的形式与之结合。IPN2是一个新型的MYB转录因子,作为与NSP2相互作用的一个伙伴,可以直接结合NIN启动子,很可能与NSP1和NSP2一起来参与调节NIN的启动子。本研究以此为背景分析了苜蓿和百脉根转录因子NSP1、NSP2和IPN2对NIN启动子的调控作用,主要研究结果如下:1.构建了NSP1和IPN2和NIN与双荧光素酶载体的融合表达载体,通过农杆菌转化烟草叶肉细胞瞬间表达,抽提蛋白,运用双荧光素酶报告基因检测系统,检测目的蛋白的生物化学发光值,分析转录因子NSP1和IPN2对NIN的调控。结果表明,NSP1和IPN2对NIN起正调控作用,二者都有较高的转录激活能力,并能在烟草叶片中检测到目的蛋白的表达。2.以野生型拟南芥(Col0生态型)为材料,摸索了其叶组织的原生质体分离条件,获得了拟南芥叶原生质体瞬时表达的体系。发现转化效率在一定范围内随PEG浓度及质粒DNA含量的升高而升高,当转化体系中PEG浓度为20%,酶解3 h,质粒DNA含量为1-1.5μg/μL,25℃过夜培养12 h,原生质体细胞数目大约为2×105m L–1个时转化效率最高。3.在拟南芥叶原生质体瞬时表达转化效率高的基础上,共转化连接在双荧光素酶载体上的NSP1、NSP2、IPN2及NIN,在外源基因瞬时表达之后,运用双荧光素酶系统,对其表达情况进行实时测定。实验结果表明,NSP1、NSP2和IPN2正调控NIN启动子,其中,NSP1对NIN有较强的激活能力,双荧光素酶比值达11倍,NSP1的比值为10,IPN2为2.88,NSP1调控作用最强,IPN2相对较弱。4.两个或两个以上转录因子共转拟南芥叶原生质体,观察多个转录因子对NIN启动子的调控。结果显示,多个转录因子共转激活作用没有单独的转录因子的激活能力高,但仍然能表明三者是NIN是的正调控子,最高比值达到5.25,而且NSP1和NSP2共转化效率比其他几个共转化效率好。5.为了探索苜蓿转录因子NSP1、NSP2、IPN2和ILK(IPN2 LIKE)在结瘤过程中的生物学功能,用组织化学染色的方法观察NSP1 Promoter、NSP2 Promoter、IPN2Promoter和ILK Promoter在毛根和根瘤中的表达。结果显示:接种根瘤菌后,NSP1和NSP2在根的维管束、根毛中,主根根尖、侧根原基根尖中都检测到了NSP1和NSP2的表达,NSP1在幼龄的根瘤中,GUS活性主要在根瘤的顶端,在成熟的根瘤中,维管束表达较为明显。IPN2和ILK在根和瘤中的表达量都相对减少,在侧根与主根的连接处GUS的表达较明显,在成熟的根瘤中,IPN2的GUS活性主要位于根瘤外周的维管束中,而ILK在成熟根瘤的顶端有少量表达,在根瘤外周维管束实验中没有观察到。