视黄酸(Retinoic Acid,RA)是调节生精细胞发育,进入减数分裂和精子释放的重要信号分子。Stra8(Stimulated by retinoic acid gene 8)为RA诱导反应基因,是精原细胞分化和减数分裂启动的标记因子,与男性少精子症和无精子症相关,其基因敲除(KO)雄性小鼠不育,精子发生阻滞,生精小管中缺乏减数分裂后生精细胞,减数分裂细胞周期S期异常,老年KO小鼠睾丸增大,睾丸中生精小管结构破坏,累积大量的未分化精原细胞。成功的精子发生依赖于基因表达的精确调控,Stra8是稳定持续精子发生所必须的,但其在精子发生中确切的调控机制仍然不清楚。为了探索Stra8在精子发生过程中的作用机制和调控网络,本论文从下述三个部分展开研究。第一部分:Stra8与Setd8相互作用调控精子发生的机制研究目的:探索Stra8与Setd8的相互作用调控精子发生过程中减数分裂的分子机制。方法:运用双荧光素酶报告基因实验分析Stra8与Setd8之间的转录调控关系,CHIP实验明确Setd8对Stra8转录调控结合位点;利用免疫共沉淀技术分析Stra8和Setd8相互作用的关键区域,以及Pcna与Stra8之间的相互作用关系;生精细胞系中,过表达Stra8和Setd8分析两者在生精细胞系中的表达特征;构建Stra8动态表达小鼠模型(维生素A缺乏模型和维生素A恢复模型),qRT-PCR、Western Blot和免疫组织荧光染色分析Stra8动态变化过程中Setd8,H4K20mel和Pcna的表达模式;qRT-PCR检测Stra8动态变化对细胞周期因子(Cyclin A2和Cyclin E2)和S期泛素化因子(Cu14A、Ddb1、Cdt1和Dtl)表达的影响,应用11dpp Stra8 KO小鼠对差异表达的细胞周期相关因子和泛素化相关因子的进行表达验证。结果:双荧光素酶报告基因实验和CHIP实验显示Setd8负性调节Stra8启动子的转录活性,其直接结合于Stra8基因近端启动子区域(-1364 bp),特别是包含Ebox1,Ebox2,Ebox3,DMRT1bs,RARE(DR2),RARE(DR4)结构域的区域,Stra8 作为转录因子,亦可以剂量依赖性的方式增加Setd8启动子活性。免疫共沉淀分析显示Stra8、Setd8和Pcna三者可以相互作用,Stra8截短片段F1R2(1-193 aa)(包含一段富含谷氨酸(GA-rich)无自激活活性的的区域(143-193 aa))可以和Setd8截短片段F1R2(1-213 aa)和F2R1(214-350 aa)相互作用。RA诱导P19细胞表达Stra8后,Setd8表达降低,H4K20me1表达增高;P19细胞过表达Setd8时,不能诱导Stra8表达,而RA诱导P19的同时过表达Setd8时,Stra8表达降低,H4K20me1表达增高。成功构建了 Stra8动态表达模型(维生素A缺乏模型和维生素A恢复模型),Stra8表达水平随着维生素A缺乏时间的延长表达逐渐降低至消失,恢复正常维生素A饮食后Stra8表达水平逐渐恢复至正常水平。Stra8动态表达模型中,Setd8、H4K20me1、Pcna,细胞周期因子(Cyclin A2、Cyclin E2)和泛素化相关因子(Ddb1、Cu14A、Cdt1 和 Dtl)异常表达。Stra8 KO小鼠睾丸中差异表达基因Setd8、Pcna、Cyclin E2和Ddb1的表达水平与Stra8动态表达模型中趋势一致。结论:Setd8蛋白直接结合于Stra8基因的近端启动子区域,负性调节其转录活性。Stra8和Setd8具有生精细胞细胞周期依赖性表达模式,Stra8在有丝分裂向减数分裂细胞周期的转变过程中起重要作用,其与Setd8、Pcna相互作用,且与Setd8、H4K20me1和Pcna共定位于精原细胞。Stra8动态表达模型中,Setd8、H4K20me1、Pcna、细胞周期相关因子和泛素化相关因子异常表达。Stra8和Setd8可能在细胞周期S期以Pcna依赖的方式经CDL4-Clu4A-Ddb1泛素化降解轴相互作用调节精子发生的细胞周期进程。第二部分:Stra8在雄性小鼠减数分裂Ⅰ早期中的作用研究目的:明确Stra8基因敲除(KO)小鼠精子发生阻滞的时期,观察其缺失所致减数分裂Ⅰ前期异常染色体事件,构建Stra8在精子发生中的调控网络,筛选其可能的下游靶基因。方法:利用HE染色和染色质铺展免疫荧光染色对第一个精子发生波中Stra8 KO小鼠进行睾丸组织和精母细胞染色质形态进行分析;分析11dpp Stra8 KO小鼠睾丸RNA测序筛选的差异表达基因的表达模式和信号通路;筛选出Stra8可能直接作用的基因,双荧光素酶报告基因实验、免疫共沉淀和双重免疫荧光染色验证它们之间的相互作用。结果:12dpp时,Stra8 KO睾丸中首次观察到异常的精子发生,随后,Stra8 KO小鼠生精小管中出现大量提前浓缩核的的细胞,精子发生阻滞于早期减数分裂阶段,缺乏减数分裂后生精细胞。精母细胞染色体铺展显示Stra8基因敲除后,精子发生阻滞于细线期,偶线期中晚期和粗线期精母细胞缺失,虽然有少数生精细胞发育至细线期或偶线期早期。KO睾丸中偶线期精母细胞出现异常联会,常染色体上γ-H2ax信号消退较WT慢,粗线期精母细胞染色体不完全联会、异常联会和异常配对,性染色体形成异常,常染色体转录沉默异常。RNA测序和相关文献分析后筛选并验证出15个精子发生相关的差异表达基因,其中Rhox10具有维持精原干细胞池的功能,Utf1、Pou5F1、Upp1、Inca1调节精原细胞的稳定增殖和自我更新,Nanos3和Egr4作用于精原细胞未分化状态的维持,Sohlh1 和 Rhox10 参与精原细胞分化,Prdm9、Msh5、Egr4、Mt15、Ccdc155、Dmc1、Pxt1和Asb9参与减数分裂进程,构建了 Stra8在精子发生中可能的转录调控网络图。分析Stra8 KO睾丸中差异基因的相关表达模式,提示Stra8可能直接与Rhox10、Prdm9、Msh5和Egr4相互作用。Stra8和Rhox10相互转录调控分析显示,Stra8能增加Rhox10启动子转录活性,Rhox10以剂量依赖性模式增加Stra8启动子转录活性;双重免疫荧光染色分析Stra8与Rhox10表达定位,结果显示,在成年小鼠睾丸中Rhox10高表达于精原细胞,精母细胞也有表达,细线前期精母细胞表达较弱,Stra8主要表达于精原细胞和细线前期精母细胞,两者主要共定位于精原细胞。免疫共沉淀进一步验证了 Stra8和Rhox10能够相互作用。结论:Stra8基因敲除小鼠不育,染色体不完全联会、异常联会和异常配对,性染色体形成异常,常染色体转录沉默异常,精子发生阻滞于细线期,偶线期中晚期和粗线期精母细胞缺失。Stra8参与精子发生的多个阶段,包括精原干细胞池的维持,精原细胞增殖、分化和减数分裂,可能通过Rhox10、Prdm9、Msh5和Egr4直接调控精子发生。第三部分:巴戟天多糖和淫羊藿苷在视黄酸诱导的生精细胞分化中的作用研究目的:探讨巴戟天多糖和淫羊蕾苷(ICA)对视磺酸(RA)诱导P19细胞向生精细胞方向分化的影响。方法:使用终浓度1μM、2μM、3μM、4μM、6μM和8μM的RA分别处理P19细胞24h、48h和72h,观察不同RA浓度及不同作用时间对P19细胞及Stra8表达水平的影响。用终浓度 0.0625 mg/L、0.125 mg/L、0.25 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、2 mg/L的巴戟天多糖和 2.5μM/L、5μM/L、7.5μM/L、10μM/L、20μM/L 的 ICA 分别加入 RA 诱导的 P19细胞中处理24h,MTT法检测它们对细胞增殖的影响。选用合适浓度的巴戟天多糖和ICA分别处理RA诱导的P19细胞,分析两者最佳作用时间。流式细胞仪检测巴戟天多糖和ICA对RA诱导的P19细胞凋亡的影响。qRT-PCR和Western Blot检测巴戟天多糖和ICA对RA诱导P19向生精细胞方向分化过程中Oct4、Plzf和Stra8的表达变化。结果:P19细胞在终浓度4μM RA诱导下24h,细胞状态较好,高表达Stra8,因此选用4μM RA 进行下一步实验。终浓度0.125mg/L、0.25mg/L、0.5mg/L、1 mg/L、2 mg/L的巴戟天多糖均可以促进RA诱导的P19细胞增殖,0.5 mg/L的作用浓度时促进增殖效果最佳。终浓度7.5μM/L和10μM/L的ICA可以显著促进RA诱导的P19细胞增殖,7.5μM/L时促进增殖效果更明显。终浓度0.5 mg/L的巴戟天多糖和7.5μM/L的ICA分别处理RA诱导的P19细胞24-72h,相较于对照组,巴戟天多糖处理24h和48h时显著促进细胞增殖,ICA处理24h和48h时均促进P19细胞增殖,24h作用更明显。流式细胞仪检测细胞凋亡率,发现RA诱导的P19细胞的早期凋亡率为2.31%±0.79,加入终浓度0.5mg/L的巴戟天多糖后,凋亡率为2.27%±0.62,两者之间没有统计学差异;RA诱导的P19细胞加入终浓度7.5μM/L ICA后,细胞早期凋亡率为2.32%±0.40,相较于对照组(RA+DMSO)的早期凋亡率2.15%±0.53两者无统计学差异。RA处理P19细胞后,Plzf和Stra8表达水平随着处理时间的延长表达量显著增加后降低,Oct4表达水平随着处理时间的延长表达量显著降低,提示RA诱导P19细胞向生精细胞方向分化。巴戟天多糖干预时,与仅RA处理组相比,Oct4表达水平显著降低,Stra8和Plzf显著增加;ICA干预时,与仅RA处理组相比,Oct4表达水平显著降低,Stra8和Plzf显著增加。结论:P19细胞系是一种多能胚胎癌干细胞系,4μM RA诱导后,P19向生精细胞方向分化,表达Mvh(生精细胞标志物),c-Kit(分化中的精原细胞标志物),和Stra8。4μM RA诱导P19细胞同时加入不同浓度的巴戟天多糖和ICA,发现它们均可促进RA诱导的P19细胞增殖,最佳作用浓度分别为0.5mg/L和7.5μM/L,最佳作用时间为24h。流式细胞术进行细胞凋亡分析表明巴戟天多糖和ICA对RA诱导的P19细胞的凋亡没有明显的影响。RA诱导P19细胞一段时间后,Stra8开始表达,随后显著增加,24h达到表达高峰。巴戟天多糖和ICA作用后促进了 RA诱导P19向生精细胞方向的分化进程,Oct4表达降低,Pzlf和Stra8表达显著增加。巴戟天多糖和淫羊藿苷为RA-Stra8通路相关的中药单体,通过RA-Stra8信号促进P19细胞向生精细胞方向增殖和分化。