乳蛋白是牛奶的主要成份,因其具有理想的氨基酸比例而对人类具有重要的营养价值。在生产上,研究表明日粮中添加瘤胃保护性蛋氨酸(RP-Met)可以改善奶牛机体对必需氨基酸(EAA)的吸收并促进乳蛋白合成,此外研究还发现,日粮中添加支链氨基酸(BCAA)具有进一步促进乳蛋白合成的能力。奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)是乳蛋白合成的重要场所,但是目前Met和BCAA调控BMEC乳蛋白合成的作用机制未见报道。因此,本实验拟以乳腺上皮细胞系MAC-T为研究对象,运用代谢组、转录组平台研究提高Met添加量对乳蛋白合成作用机制的影响,并进一步提高Leu、Ile和Val的添加量,考察其对乳蛋白合成作用机制的影响,以期揭示奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成的调控作用。试验一提高Met添加量对BMEC酪蛋白合成调控途径的影响以乳腺上皮细胞系MAC-T细胞为试验材料,在乳中测得的Lys:Met比例2.9:1的基础上通过提高Met添加量进行细胞培养。共3个试验组,以Lys:Met比例2.9:1为对照组(CON),提高Met添加量LM2.5组和进一步提高Met添加量LM2.0组为处理组,每个处理6个重复,每个重复一个孔,培养时间为12h。通过使用代谢组学(GC/MS)、转录组学(RNA-Seq)、qPCR以及Western blot平台及技术研究提高Met添加量对BMEC胞内代谢、基因转录表达、蛋白磷酸化水平以及酪蛋白基因CSN1S1和CSN2表达量的影响。结果表明:1)提高Met显著促进了BMEC胞内Met、Lys、Arg、Phe以及BCAA的降解,降低了EAA的利用效率;代谢通路分析结果表明,提高Met添加量对Aminoacyl-tRNA biosynthesis代谢途径具有显著抑制作用;2)提高Met添加量显著提高了氨基酸转运载体SLC3A2但是显著降低了氨基酸转运载体SLC7A5、SLC36A1、SLC38A2、SLC38A9和SLC43A1的mRNA表达量,与LM2.5组比较,进一步提高Met LM2.0组显著提高了SLC38A9和SLC43A1的mRNA表达量;3)在转录水平上,提高Met添加量LM2.5组导致了113个基因表达量发生变化,其中68个基因表达量显著上调,45个基因表达量显著下调;LM2.0组导致了71个基因表达量发生变化,其中38个基因表达量显著上调,33个基因表达量显著下调。提高Met添加量在转录水平上对蛋白合成相关通路p53 signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、protein kinase binding、regulation of phosphorylation、positive regulation of peptidyl-serine phosphorylation和PI3K-Akt signaling pathway具有显著调控作用,其中显著激活了mTOR pathway上游活性抑制通路p53信号通路和显著降低了mTOR pathway活性激活通路PI3K-Akt的活性,并且显著降低了mTOR pathway下游HIF-1信号通路的活性,qPCR验证试验中提高Met显著降低了mTOR正调控因子RHEB、S6K1和EIF4E的表达量,从而表明提高Met抑制了mTOR通路的活性;4)提高Met添加量显著提高Akt但是显著降低了mTOR的磷酸化水平,说明Met主要通过蛋白翻译后磷酸化水平抑制mTOR通路活性,抑制了β-酪蛋白基因的表达。提高Met对酪蛋白合成的调控通路具有抑制作用。试验二提高BCAA添加量对BMEC酪蛋白合成的调控途径的影响本试验在试验一的基础上,采用相同对照组,分别以其中Lys:Ile=1.45:1、Lys:Val=1.23:1和Lys:Leu=0.85:1比例中的Ile、Val和Leu添加水平为对照,在此基础上进一步提高BCAA(Ile、Val和Leu)的添加量进行细胞培养。试验共4个组,分别为CON、提高Ile组(LI1.29)、提高Val组(LV1.12)和提高Leu组(LL0.78),每个处理6个重复,每个重复一个孔,处理时间为12h。通过使用代谢组学(GC/MS)、转录组学(RNA-Seq)、qPCR以及Western blot平台及技术研究BCAA对乳蛋白合成的影响及调控机理。结果表明:1)提高Val添加剂量(LV1.12)显著提高了EAA(His、Met、Ile和Leu)、NEAA(Gln、Glu、Ser、Gly和Asp)浓度以及磷酸、尿酸、N-乙酰谷氨酸和果糖的浓度,但是显著降低了葡萄糖-6-磷酸的浓度,LI1.29组提高MAC-T胞内AA(Pro,Leu,Asp,Glu和Gln)的浓度以及尿酸、N-乙酰谷氨酸、乙醇酸的浓度,显著降低了丙酮酸、戊二酸、磷酸、核糖-5-磷酸、3-磷酸甘油、1,2,4-苯酚和3-羟基丙酮酸的浓度,LL0.78组提高MAC-T胞内磷酸、尿酸和琥珀酸的浓度,显著降低了葡萄糖-6-磷酸、丙酮酸、磷酸和富马酸的浓度;代谢通路分析发现提高BCAA对涉及AA代谢的BCAA合成代谢通路、Ala-Asp-Glu代谢通路、Cys-Met、Glu-Gln代谢通路、Gly-Ser-Thr代谢通路和Arg-Pro代谢通路代谢通路具有调控作用;2)Leu显著增强了AA转运载体(SLC3A2,SLC7A5,,SLC36A1,SLC38A2和SLC38A9)的基因表达量,Val显著增强了BMEC胞内AA转运载体(SLC3A2和SLC38A9)的基因表达量,Ile显著增强了SLC3A2,但是显著降低了(SLC7A5,,SLC38A2和SLC38A9)的基因表达量,BCAA对氨基酸转运载体表达量调控强弱顺序为Leu>Val>Ile;3)在转录水平上,提高Val导致了951个差异表达基因,提高Leu导致了157个差异基因,提高Val和Leu对蛋白合成相关信号调控通路mTOR pathway和PI3K-Akt pathway、翻译起始因子活性、蛋白磷酸化酶结合和磷酸化调控通路都具有显著影响,其中提高Val上调了mTOR通路活性,提高Leu显抑制了mTOR通路的活性;4)蛋白磷酸化水平上,提高Val显著提高了Akt、mTOR、S6K1和RPS6,并降低了EIF2α的磷酸化水平,增强了mTOR pathway的活性。提高Ile显著提高了mTOR、4EBP1、RPS6并降低了EIF2α和EEF2的磷酸化水平,增强了mTOR pathway的活性,提高Leu显著降低mTOR的磷酸化水平,对mTOR pathway活性存在抑制作用;5)提高BCAA显著提高了α-S1酪蛋白基因的表达量,提高Val显著促进了β-酪蛋白的基因表达,但提高Ile显著降低了β-酪蛋白的基因表达。提高Val对酪蛋白合成的调控通路活性具有增强作用。综上所述,Met,Ile,Val和Leu对BMEC酪蛋白合成信号通路的调控存在差异性,提高Met具有通过在磷酸化水平上降低mTOR蛋白活性从而抑制酪蛋白合成调控通路的作用;提高BCAA对酪蛋白合成调控通路活性具有不同影响,提高Val和Ile在磷酸化水平上增强了mTOR pathway活性,提高Leu减弱了mTOR pathway活性,仅提高Val同时增强了α-S1酪蛋白和β-酪蛋白的基因表达,Val是BCAA中正向调控酪蛋白合成调控通路活性的重要氨基酸。