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雌激素在脊椎动物性别决定与分化过程中发挥着重要作用,被认为是硬骨鱼类卵巢发育的天然诱导剂。芳香化酶是雄激素转变为雌激素所必须的重要酶类,因而在鱼类性别决定与分化、性腺发育与维持及生殖周期的调控等多种生理生化过程中具有重要作用。与四足动物不同的是硬骨鱼类中存在性腺型与脑型两种不同的芳香化酶,分别由在性腺中高表达的cyp19a1a与在脑中高表达的cyp19a1b编码。目前有关芳香化酶基因的研究主要集中在cyp19a1a在性腺以及cyp19a1b在脑中的表达与作用,但有关cyp19a1b在性腺中的表达及其在鱼类性别决定与分化过程中作用的研究还相对较少。淇河鲫(Carassius auratus)作为河南特有的种类,其可以通过有性生殖与雌核发育两种方式产生后代,是研究单性生殖(雌核发育)鱼类性别决定与分化机制很好的材料。本研究以淇河鲫为材料,利用RACE方法克隆得到淇河鲫cyp19a1b基因cDNA全长序列,并分别从RNA水平及蛋白水平检测其在淇河鲫成鱼各组织及胚胎与胚后发育各时期的表达模式,同时检测了Letrozole诱导性逆转前后及腹腔注射hCG后该基因在性腺与脑中的表达变化,主要的研究结果如下:1.本研究以淇河鲫成鱼脑组织总RNA为模板,利用RACE方法克隆得到cyp19a1b基因cDNA全长,经测序拼接得到cyp19a1b cDNA全长2984 bp(GenBank ID:MF926270),序列分析发现其包含132 bp 5′非编码区,1319 bp 3′非编码区,1533 bp开放读码框,编码510个氨基酸残基,预测相对分子质量58.11 kDa,蛋白等电点7.57;氨基酸序列比对发现该基因具有细胞色素P450家族典型的5个结构域:跨膜区、I-螺旋区、特异的芳香化区、Ozol’s区以及血红素结合区,并具有该家族血红素结合的保守基序F-X-X-G-X-R-X-C-X-G(淇河鲫中为F-G-C-G-P-R-A-C-V-G);系统进化分析结果显示,淇河鲫Cyp19a1b与鲤科鱼类聚为一小支,与非鲤科鱼类聚为一大支并与其他鱼类Cyp19a1a分为独立的两支。这与其分类地位一致,由此确定克隆得到的序列是淇河鲫脑型芳香化酶(cyp19a1b)基因。2.利用荧光定量PCR的方法检测cyp19a1b基因mRNA在淇河鲫成鱼各组织、胚胎发育各时期以及胚后各时期脑与性腺中的表达情况。成鱼各组织定量结果显示,该基因在淇河鲫成鱼脑中的表达量显著高于卵巢及其他组织;胚胎及胚后发育各时期定量结果显示,该基因的表达量自囊胚期开始逐步上调,在神经胚达到最高,随后降低。出膜后,随着个体的发育该基因在脑中的表达量逐步上调,在150 dah(dah,days after hatching)达到最高,并一直维持在较高水平;在性腺中的表达量虽然显著低于在脑中的表达量,但随着个体发育的进行同样呈现出升高后降低的趋势,在30~40 dah达到最高,以上研究结果表明该基因在淇河鲫的神经系统形成及神经内分泌、性别决定、脑性化以及卵巢维持等方面可能发挥了重要作用。3.淇河鲫可通过两性生殖和雌核发育两种方式繁殖后代,在繁殖季节用异源精子刺激淇河鲫,受精卵将经过雌核发育产生全雌个体。为探讨cyp19a1b在淇河鲫脑中的表达是否存在性差,本研究使用来曲唑(Letrozole)处理5 dah淇河鲫仔鱼60 d使其发生性逆转。定量结果显示,淇河鲫性逆转后cyp19a1b在脑中表达量显著降低,暗示了该基因可能通过控制脑内雌激素的合成在卵巢发育及维持过程中发挥了重要的作用。除此之外,研究发现腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin,hCG)可以促进cyp19a1b在脑中表达,表明外源激素水平对于cyp19a1b在淇河鲫脑中表达具有调控作用。4.为探讨Cyp19a1b在淇河鲫成鱼各组织及胚后发育各时期脑及性腺中表达情况及表达的细胞类型,我们在克隆到cyp19a1b cDNA的基础上制备了淇河鲫Cyp19a1b的多克隆抗体,SDS-PAGE电泳检测结果发现重组蛋白经诱导纯化之后,在大约44 kDa处具有单一的条带,证明纯化成功;除此之外,Cyp19a1b多克隆抗体可以特异的识别经IPTG诱导过后的淇河鲫Cyp19a1b重组蛋白,分子量约为44 kDa,同时在淇河鲫脑总蛋白中识别大小约为44 kDa左右的单一条带,说明Cyp19a1b抗体具有较好的特异性。5.利用制备所得多克隆抗体,通过Western blot及免疫组织化学的方法检测Cyp19a1b在淇河鲫成鱼各组织及胚后发育各时期脑及性腺中表达情况。Western blot结果显示,Cyp19a1b在淇河鲫脑中表达量最高,在性腺、肝等组织表达量较低;免疫组化结果显示,随着个体发生的进行,Cyp19a1b从20 dah开始表达于脑的放射性胶质细胞,从30 dah开始表达于卵巢体细胞;Letrozole诱导淇河鲫性逆转后,在精巢的间质细胞中也检测到Cyp19a1b的表达,但Cyp19a1b在雄性个体脑及性腺中表达量明显低于雌性个体,以上结果与RT-PCR结果基本一致,也进一步证实了Cyp19a1b在淇河鲫性别决定与分化中的作用。综上所述,无论是mRNA水平还是蛋白水平,淇河鲫Cyp19a1b均在淇河鲫成鱼脑中高表达,伴随着Letrozole诱导的性逆转表达量明显降低;定量结果显示该基因在胚胎发育中的神经胚表达量最高,随着淇河鲫个体发生的进行,cyp19a1b在脑中的表达量自20 dah开始逐步上调,在150 dah达到最高;在性腺中的表达则呈现先升高后降低的趋势,在淇河鲫性别决定关键时期(30~40 dah)表达量达到最高;免疫组织化学结果显示,从20 dah脑型芳香化酶就开始在脑的放射性胶质细胞中表达,30 dah开始检测到其在卵巢体细胞表达,同时也表达于精巢的间质细胞,表明了其在淇河鲫神经系统形成以及通过神经内分泌调节雌激素水平在性别决定与分化及性腺发育维持过程中可能发挥了重要作用。