基因工程产品的生产是一项十分复杂的系统工程，可分为上游和下游两个阶段，以分离目的基因、构建工程菌为主要内容的上游工艺是研制基因工程产品必不可少的基础，而作为下游工艺核心内容的工程菌的发酵培养、目的蛋白的分离纯化却直接控制着整个基因工程产品的质量、产量。本课题利用基因工程技术，重点从基因工程下游阶段着手研究，利用最新现代生物技术研究并建立经优化的高密度发酵工艺模式及高效分离纯化包涵体重组蛋白模式。 一．研究并建立一种适于目的蛋白高效表达的高密度发酵工艺模式 高密度发酵中，人们最关心的问题主要是质粒稳定性的维持、外源基因的高效表达及对下游纯化的影响。针对这些问题，我们采用分批补料培养的方法优化发酵培养基配方及部分发酵条件，探索出即适于外源基因高效表达，又利于产品纯化的发酵工艺。以我室构建并稳定表达的重组质粒pBV220-γ-IFN、pBV220-HGFα、pBV220-HGFβ、pBV220-hPK5为模型，分别从不同的表达宿主菌中筛选出一种适合大规模生产的菌种BL21（DE3），该工程菌株连续传代100代表达质粒不丢失，表达量稳定；采用B.Braun公司的BIOSTAT-C15L自控发酵罐，运用分批补料技术分别进行四种工程菌的高密度发酵，通过优化工程菌发酵的培养基配方及优化部分发酵条件（通气量、搅拌速度、补料速度），最终建立一种适于目的基因高效表达的高密度发酵工艺模式。发酵密度OD₆₀₀=40—42，SDS—PAGE及凝胶密度扫描分析目的基因产物占菌体总蛋白20％以上。 二．研究并建立一种包涵体中高效分离纯化目的蛋白的优化模式 重组蛋白分离纯化工艺中分离效率的提高、生物活性效率的提高及工艺的稳定性是尤其重要的，针对这些问题，我们在层析纯化前尽山西医科大学生物化学与分子生物学2003届硕士学位论文可能地提高包涵体纯度，并选择合适层析方法的同时合理的组合色谱分离单元。以大肠杆菌内包涵体形式表达的重组蛋白重组人Y一工FN、HGFa、HGFp、hPKS为模型，系统研究包涵体的洗涤及其色谱层析纯化工艺，采用超声接合溶菌酶法破碎菌体后，用含有低浓度尿素的包涵体洗涤液反复超声洗涤，采用最新反相色谱纯化技术SOUCE30RPC分离包涵体蛋白，经SDS一PAGE及凝胶密度扫描分析，目的基因产物占菌体总蛋白的90%以上，杂蛋白明显减少;包涵体复性后，采用AKTApurifier层析仪、Sepharose Fast Flow、Sephaerayl系列凝胶填料以及HitraP Selection Kit及XK型系列层析柱利用不同目的蛋白的各种理化特性不同运用三步纯化策略对重组人7一IFN、HGFa、HGFp、hPKS分别进行高效色谱纯化，筛选优化条件从而建立了一种有效的从包涵体中分离纯化目的蛋白易于放大的工艺模式，纯化产物纯度>98%。结论: 总之，通过对发酵罐中重组工程菌各种培养因素的研究，建立了一种高密度、高表达发酵工艺体系，为重组蛋白的后续纯化提供了大量、稳定的原料供应;通过对不同目的蛋白的色谱行为的系统研究，建立了一种高效稳定、快速简洁、易于放大的包涵体重组蛋白分离纯化体系。目前，利用基因工程技术生产目的蛋白已在我国得到广泛发展，对于重组产物而言其下游工艺尤其重要，本课题为基因工程下游发酵、纯化工艺路线探索出一个切实可行的程序，同时也为基因工程产品产业化放大提供了一个有益的借鉴。