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作为一类重要的抗氧化酶,谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）在清除体内ROS方面发挥着重要的作用。本实验室前期研究制备了高活性和高产率的谷胱甘肽过氧化物酶突变体（GPxM）。然而,GPxM和大多数天然酶类相似,较短的体内半衰期、对蛋白水解酶的高敏感性及较强的免疫原性限制了其临床应用。为更好地应用GPxM,增强其疗效,本课题采用聚乙二醇修饰策略对谷胱甘肽过氧化物酶突变体进行聚乙二醇修饰,以期获得能够更好地发挥GPxM抗氧化作用的药物新剂型,为进一步拓宽谷胱甘肽过氧化物酶突变体的应用提供科学依据。研究分为2部分:1.GPxM的低分子量聚乙二醇修饰及药学性质研究本实验首先合成SS-mPEG5kDa,并将其分别与GPx1M和GPx4M共价偶联,获得相应的聚乙二醇化GPxM,通过SDS-PAGE、CD、IF、DLS等手段表征SS-mPEG5kDa-GPx1M 和 SS-mPEG5kDa-GPx4M。利用 LC-ESI-MS 确定 GPx1M的聚乙二醇修饰位点。通过测定修饰前后GPx1M的剩余酶活力,分析5 kDa聚乙二醇修饰对GPx1M稳定性的影响。使用2.5 μM阿霉素（ADR）诱导H9c2细胞损伤,评估GPx1M和SS-mPEG5kDa-GPx1M在体外预防和治疗ADR所致心脏毒性的作用。通过ELISA法探讨修饰前后GPx1M的体内药代动力学规律。本实验通过一次性腹腔注射ADR的方式构建ADR所致大鼠心脏毒性模型,探讨GPx1M和修饰产物对ADR所致心脏毒性的抗氧化作用。结果如下:（1）本实验成功合成了 SS-mPEG5kDa。（2）本实验成功得到修饰产物SS-mPEG5kDa-GPx1M和SS-mPEG5kDa-GPx4M,且低分子量聚乙二醇修饰不会改变GPxM原有的二级和三级结构,GPx1M的聚乙二醇修饰位点为Lys 38。（3）聚乙二醇修饰并未明显改变GPx1M的酶活力、动力学机制、最适温度和最适pH,且修饰产物的稳定性明显强于GPx1M。（4）修饰前后GPx1M的体外抗氧化能力相当。预防性/治疗性给予GPx1M和修饰产物均能有效降低H9c2细胞的凋亡率、ROS水平和MDA含量,提高细胞内LDH水平,且预处理组效果强于治疗组。（5）GPx1M和SS-mPEG5kDa-GPx1M可有效缓解ADR诱导的大鼠心脏毒性,及时消除过多ROS,且修饰产物的抗氧化作用强于GPx1M。（6）聚乙二醇修饰可明显延长GPx1M在大鼠体内的循环半衰期,降低肾清除率,提高生物利用度。2.GPxM的高分子量聚乙二醇修饰及药学性质研究本实验采用SS-mPEG20kDa修饰GPx1M和GPx4M。产物经SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS、CD、IF、DLS等技术手段表征,LC-ESI-MS确定聚乙二醇修饰位点。通过酶活力测定探讨高分子量聚乙二醇修饰对GPxM的稳定性和催化还原过氧化氢的微环境的影响。通过一次性腹腔注射ADR构建大鼠心脏毒性模型,同时给予大鼠高、中、低剂量GPxM和相应修饰产物,探讨高分子量聚乙二醇化GPxM对ADR诱导大鼠心脏毒性的保护作用。通过ELISA法分析大鼠体内GPxM和修饰产物的药代动力学参数,初步探究修饰产物的药代动力学规律。利用BALB/c小鼠初步评估修饰产物的免疫原性和安全性,确定药物的安全性。结果如下:（1）GPx1M和GPx4M与SS-mPEG20kDa发生偶联修饰,每个单体上仅连接一个SS-mPEG20kDa,高分子量聚乙二醇修饰不会改变GPxM的二级和三级结构,GPx1M和GPx4M的聚乙二醇修饰位点分别为Lys 38和Lys 164。（2）高分子量聚乙二醇修饰未明显改变GPxM原有酶活力、酶促反应动力学机制、最适温度和最适pH,经修饰后GPxM的稳定性显著增强。（3）聚乙二醇化GPxM可有效缓解ADR诱导的心脏毒性,且呈现剂量依赖性。和ADR组相比,GPxM低剂量组的心脏损伤指标变化和ADR组类似,其余给药组大鼠的心脏毒性损伤指标明显得到改善,聚乙二醇化修饰产物组的改善作用均强于相应的GPxM组,且SS-mPEG20kDa-GPx1M组的改善作用最强。（4）聚乙二醇修饰可明显改善GPxM的药代动力学参数,且循环半衰期随聚乙二醇分子量和GPxM分子量的增大而延长。GPx1M、GPx4M及其相应修饰产物经肾清除的累积排泄总量占给药剂量的百分比均很低,说明上述物质在体内存在代谢消除途径。（5）聚乙二醇修饰可明显降低GPxM的免疫原性。在给定剂量内,GPxM和相应修饰产物对小鼠未产生明显毒副作用。综上所述,GPxM和修饰产物具有良好的抗氧化能力。本研究对GPxM进行不同分子量聚乙二醇修饰,分别从细胞水平和动物水平探讨GPxM和聚乙二醇化GPxM的抗氧化作用以及药代动力学规律,所得结论如下:1.不同分子量聚乙二醇修饰均不会明显改变GPxM原有的二级和三级结构以及酶活力。2.在体外研究中,GPx1M和SS-mPEG5kDa-GPx1M对ADR诱导H9c2细胞损伤具有保护作用,且二者的体外抗氧化能力相当。3.在体内研究中,GPxM和修饰产物对ADR所致大鼠心脏毒性均具有保护效果,抗氧化作用呈剂量依赖性,且修饰产物的抗氧化作用强于GPxM,SS-mPEG20kDa-GPx1M的抗氧化作用最为显著。4.在药代动力学研究中,聚乙二醇修饰能明显改善GPxM在大鼠体内的药代动力学参数。5.在免疫原性和安全性研究中,聚乙二醇修饰可以降低GPxM的免疫原性,对小鼠主要脏器没有明显毒副作用。