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背景和目的
正畸牙槽骨改建的第一步是牙槽骨的吸收,成熟的破骨细胞(osteoclast,OC)是唯一行使骨吸收功能的细胞,而OC的分化和成熟有赖于成骨细胞(osteoblasts,OB),的参与和调节。机械力诱导OB产生多种物质和细胞因子,通过多种途径和机制参与和调节OC的分化和功能。目前发现的调节OC的分化和功能的诸多因素中,核转录因子kB受体活化因子配基(receptor activator of NF-κBligand,RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)是两个关键因子。一些炎性细胞因子也参与牙槽骨的吸收过程,如白细胞介素(interleukin,IL)-1,IL-6,肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α等,能够直接或间接促进OC的分化和活化,又被称为骨吸收炎性因子。此外,前列腺素(prostaglandin,PG)E2在骨吸收中也发挥着重要的作用,可调节炎症反应,刺激OC分化从而诱导骨吸收。在正畸牙移动的龈沟液中,PGE2的表达水平较高。本研究相关的前期实验中发现,压力通过上调成骨细胞表达PGE2诱导OC形成,而PGE2能上调M-CSF的表达和下调OPG的表达。
IL-17,最初由活化的T细胞(TH17)克隆而来,在多种自身免疫疾病和炎性疾病中具有重要作用。IL-17结构独特,与其他已知的蛋白和白介素的结构没有相似性,在人类和鼠类的基因组包括至少6个成员(A-F)和5个受体成员(RA-RE)。而功能方面,IL-17具有强大的促炎症作用和骨吸收的作用。近年来的研究发现,IL-17上调巨噬细胞或单核细胞内RANKL的表达而促进破骨细胞的分化。IL-17可促进IL-1β,TNF-α的合成,诱导IL-6和IL-8在成纤维细胞内的表达。在成骨细胞内,可增强TNF-α、PGF2α诱导IL-6的合成作用。作为最新发现的促进炎症和骨吸收的细胞因子,IL-17的作用独特而强大。因此,我们设想IL-17参与了正畸牙槽骨吸收的过程,通过OB促进OC的分化和活化。但是正畸力诱导IL-17在成骨细胞内的表达情况,IL-17介导OB诱导OC分化的作用和机制,目前国内外尚无报道。
因此,本研究通过检测压力作用下IL-17及其受体在成骨细胞内的表达；研究IL-17A调节OC分化相关因子在OB内表达的作用及其机制；检测IL-17调节成骨细胞诱导OC分化的作用,探讨IL-17在体外介导成骨细胞诱导破骨细胞的作用,为进一步阐明正畸牙移动和牙槽骨改建的分子生物学机制提供理论和实践依据。
实验方法
1.检测压力作用下,IL-17及其受体在成骨细胞内的表达情况。
以来自新生小鼠颅骨的细胞系MC3T3-E1作为成骨细胞,用含10％FBS的α-MEM培养,两天换液一次。按2.0×104 cells/cm2的密度将MC3T3-E1细胞接种于96孔板,用含50mM磷酸甘油和50μg/ml抗坏血酸的培养液培养7-10天,茜素红染色观察矿化结节。MC3T3-E1细胞按相同密度接种于100mm的培养皿,待细胞融合80％,换用含1％FBS的α-MEM培养液培养12h后,开始施加压力。按照实验室以往研究,采用细胞均匀加力装置施加0,1.0,2.0或3.0g/cm2(0、98,196或294Pa)的压力,加力时间分别为1,3,6,9,12或24h。活细胞计数试剂盒(CCK)检测压力对MC3T3-E1细胞生长的影响。选择对细胞尘长影响小的1.0和2.0g/cm2作为实验组。加力结束后,采用实时定量RT-PCR检测IL-17家族(A-F),IL-17受体(receptor,R)家族(RA-Re)和IL-1α,IL-6 mRNA表达情况,细胞免疫荧光技术和ELISA方法检测加力9h后IL-17A蛋白表达情况。
按2.0×104 cells/cm2的密度将MC3T3-E1细胞接种于100mm的培养皿,待细胞融合80％,换用含1％FBS的α-MEM培养液培养12h后,加入0或10ng/ml的IL-17A继续培养6、24或72h,实时定量RT-PCR检测IL-17RA-RE mRNA表达情况。
2.检测IL-17A调节OC分化相关因子在OB内表达的作用及机制.
按2.0×104 cells/cm2的密度将MC3T3-E1细胞接种于100mm的培养皿,待细胞融合80％,换用含1％FBS的α-MEM培养液培养12h后,加入0、0.1、1或10ng/ml的IL-17A继续培养6、12、24、48或72h,未添加IL-17A的为对照组,添加0.1、1或10ng/ml的IL-17A的为实验组。实时定量RT-PCR检测COX-1,COX-2,RANKL,OPG,M-CSF,IL-1α,IL-6,TNF-α mRNA表达情况,ELISA方法检测24h时,PGE2,RANKL,OPG,M-CSF,IL-1α,IL-6,TNF-α蛋白表达情况。
按2.0×104 cells/cm2的密度将MC3T3-E1细胞接种于100mm的培养皿,待细胞融合80％,换用含1％FBS的α-MEM培养液培养12h后,加入0或1.5ng/ml的PGE2继续培养24h或72h。实时定量RT-PCR方法检测72h时,RANKL,OPG,M-CSFmRNA表达情况；实时定量RT-PCR方法检测24h时IL-1α,IL-6,TNF-αmRNA表达情况。
按2.0×104 cells/cm2的密度将MC3T3-E1细胞接种于100mm的培养皿,待细胞融合80％,换用含1％FBS的α-MEM培养液培养12h后,加入0或10ng/ml的IL-17A和/或10μM塞来昔布(COX-2抑制剂)继续培养24h。ELISA方法检测24h时,PGE2,RANKL,OPG,M-CSF,IL-1α,IL-6,TNF-α蛋白表达情况。
3.检测IL-17A调节成骨细胞诱导破骨细胞分化的作用和机制.
按2.0×104 cells/cm2的密度将MC3T3-E1细胞接种于100mm的培养皿,待细胞融合80％,加入0或10ng/ml的IL-17A的含1％FBS的α-MEM继续培养72h。再换用含1％FBS的α-MEM培养12h,收集细胞培养上清。按照30％的比例与含10％FBS的α-MEM混合,加入50ng/ml的RANKL,作为条件培养液。以鼠源性单核-巨噬细胞系RAW264.7作为破骨细胞前体,用含10％FBS的α-MEM培养,2天换液一次。按1.25×104 cells/cm2的密度将RAW264.7细胞接种于96孔板,孵育24h后,换用条件培养液培养3,5,7或10天,抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色鉴定和计数破骨细胞。按1.25×104 cells/cm2的密度将RAW264.7细胞接种于6孔板,孵育24h后,换用条件培养液培养3,5,7或10天,实时定量RT-PCR和Western-blot方法分别检测组织蛋白酶(cathepsin)K,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-9和碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA)Ⅱ mRNA和蛋白表达情况。
按2.0×104 cells/cm2的密度将MC3T3-E1细胞接种于100mm的培养皿,待细胞融合80％,加入的IL-17A(0或10ng/ml)和/或10μM塞来昔布的含1％FBS的α-MEM继续培养72h。再换用含1％FBS的α-MEM培养12h,收集细胞培养上清。按照30％的比例与含10％FBS的α-MEM混合,加入50ng/ml的RANKL,作为条件培养液。按1.25 X104 cells/cm2的密度将RAW264.7细胞接种于96孔板或6孔板,孵育24h后,换用条件培养液培养7天,TRAP染色鉴定和计数破骨细胞,Western-blot方法检测组织蛋白酶K,MMP-9和CAⅡ蛋白表达情况。