在20世纪80年代初,Cech和Altman等分别在四膜虫内含子和细菌RNase P中发现具有催化功能的RNA分子,称为核酶,其发现打破了“酶即蛋白质”的传统学术观念,是酶学研究的一个重要突破,直接促进DNA催化功能研究与发展。1994年,Breaker和Joyce通过体外进化方式获得了一种催化RNA断裂的单链DNA分子,即脱氧核酶,为酶家族增添了新成员,是酶学研究的一次重要进步。迄今为止,脱氧核酶绝大多数是通过体外进化获得,其催化类型大体可分为3类:断裂活性、连接活性以及修饰活性,其中断裂活性脱氧核酶占大多数。近年来,脱氧核酶在基因沉默,DNA分子装置以及生物传感器等方面表现出较高的应用价值和较广泛的应用前景。2013年,Breaker实验室报道通过体外进化获得一系列以Zn2+作为辅因子且具有DNA断裂活性的脱氧核酶,其中I-R3催化活性最高。I-R3脱氧核酶二级结构呈现“茎-环-茎”结构,脱氧核酶催化核心位于“环”结构,由15个脱氧核苷酸组成,酶与底物识别结合区域为“茎”结构。在本论文中,我们以I-R3脱氧核酶为研究对象,在酶学性质、构效关系、突变体A5G以及应用等4个方面进行研究与探索。基于I-R3脱氧核酶顺式结构,我们设计了2种结构脱氧核酶:I-R3N和I-R3S。在Zn2+浓度、热变性、NaCl浓度、KCl浓度、金属离子选择性、抗金属离子干扰性、pH值以及反应时间等条件下,对I-R3N和I-R3S脱氧核酶催化活性影响进行了较为细致的表征。实验结果显示I-R3N和I-R3S脱氧核酶催化活性与Zn2+浓度密切相关,最适浓度为10 mM,对其有严格的专一性,并表现出对Mg2+、Ca2+等离子强抗干扰能力;同时也显示热变性不能增强催化活性,而NaCl和KCl对活性有抑制作用;反应体系pH对二者活性影响较大,最适pH为7.0,反应60分钟后,催化效率趋向稳定。在最适反应条件下,I-R3N脱氧核酶催化活性高于I-R3S,因此我们选择I-R3N脱氧核酶进行构效关系研究。在pH 6.0、7.0以及8.0等不同条件下,对I-R3N脱氧核酶催化核心57个突变体进行活性比较,随后又进行了第二轮多位点突变,明确催化核心内脱氧核苷酸与催化活性关系,确定突变热点以及发现高活性突变体A5G。同时,对此I-R3N、I-R3S以及突变体A5C断裂位点进行了细致鉴定与分析。继之,我们在Zn2+浓度、金属离子选择性、抗干扰性、pH值以及反应时间等条件下针对高活性突变体A5G进行了酶学性质表征。最后,基于荧光共振能量转移原理,我们在I-R3N脱氧核酶5’和3’端分别化学修饰荧光和淬灭分子,通过检测荧光强弱来直接判断其催化活性变化。在此基础上,期望研究发展出一种高灵敏Zn2+荧光型传感器,由脱氧核酶酶学基础研究扩展至酶工程应用研究。