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弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种原虫,属专性细胞内寄生的顶复门,可以引起严重的人畜共患弓形虫病。弓形虫病在全球范围内流行与分布,2013年在美国CDC发表的数据显示弓形虫在美国的感染率达到22.5%,全球的约33%的人类患有弓形虫病。我国各地均有人体弓形虫感染的报告,感染率约为5%～10%。虽然弓形虫感染的患者多呈现轻微类似流感样症状,但对于免疫缺陷的患者却是十分危险的隐患。关于移动联结成员AMA1、RON2、5、8的功能的研究已有报道,然而在对于弓形虫和疟原虫中,无法通过基因敲除的手段获得RON4的基因缺失虫株,RON4 一直以来被猜测为弓形虫、疟原虫入侵宿主细胞所必须的基因,但并没有直接的证据对这个猜测进行佐证,因此,RON4基因的功能一直以来都是未知的。本研究根据弓形虫基因组数据库ToxoDB和NCBI基因组数据库Genebank中TgRON4（登陆号:TGGT1229010）和TgRON5（登陆号:583.m00636）的基因序列,对两基因的信号肽及跨膜域、亲水性进行了初步分析。截取部分序列,设计引物对两基因进行截短扩增,并通过限制性内切酶BamHI和xhoI克隆至原核表达载体pGEX-4T-3中。对融合GST标签的目标蛋白进行原核表达和纯化。经SDS-PAGE鉴定,分别获得约30kDa和701kDa的两蛋白,且重组蛋白的浓度较高、纯度较好。将TgRON4t和TgRON5t蛋白按照100μg/只的剂量腹腔免疫小鼠,获得多克隆抗体。利用Western b1ot方法鉴定本研究中制备的多克隆抗体的抗原性,结果显示,本研究中所获得的anti-TgRON4和anti-RON5多克隆抗体均能够识别虫体裂解蛋白中的内源性TgRON4和TgRON5蛋白,大小分别为130kDa和110kDa,与预期相符。利用制备的anti-TgRON4和anti-TgRON5抗体对弓形虫速殖子中TgRON4和TgRON5蛋白进行定位分析,结果显示,两种多克隆抗体均能够与识别内源性的TgRON4和TgRON5蛋白,并且正确定位于速殖子顶端的棒状体部位。证明本研究中所制备的多克隆抗体具有良好的抗原性。本研究利用CRISPR-Cas9技术对弓形虫速殖子MJ成员RON4进行基因敲除。首先设计目标gRNA,通过overlap PCR将目标gRNA序列扩增出来,采用pmeⅠ限制性酶切位点克隆到敲除载体中,经过鉴定,本研究成功构建TgRON4基因敲除质粒。将敲除质粒通过电穿孔的方式转染入弓形虫速殖子中,经过药物筛选和有限稀释法分选到两株单克隆虫株——△ TgRON4-2D10和△ TgRON4-2G8。设计一系列引物对两单克隆虫株基因组gRNA位点发生的突变情况进行了鉴定,结果表明,在弓形虫RON4基因组中一个gRNAPAM序列前插入了一段约5700bp的片段,在另一个gRNA PAM序列前缺失了 5bp碱基,两虫株在RON4基因位点均发生了基因编辑。随后利用本研究制备的多克隆抗体anti-TgRON4,通过Western blot在蛋白表达水平鉴定了 RON4基因敲除的情况,结果显示,在△TgRON4-2D10和△ TgRON4-2G8虫株均未能检测到目标蛋白的存在,通过间接免疫荧光分析也得到了相似的结果,在△ TgRON4-2D10和△ TgRON4-2G8虫株中并未检测到TgRON4蛋白的表达和定位。本研究成功利用CRISPR-Cas9技术获得弓形虫速殖子的TgRON4基因的稳定缺失虫株。在弓形虫RON4缺失虫株中（△TgRON4-2D10和△TgRON4-2G8）对MJ关键成员TgRON5的定位情况及蛋白表达水平进行了分析。通过间接免疫荧光试验在缺失虫株中对RON5的定位进行分析,结果显示,在TgRON4基因缺失虫株中,RON5可以定位于棒状体颈部的位置。然而western blot检测RON5蛋白的表达水平显示,TgRON4基因缺失虫株与Cas9对照虫株相比,RON5的蛋白表达水平显著下降。表明RON4的缺失影响了 RON5蛋白的表达或者稳定性。为探究弓形虫RON4基因在虫体入侵等方面发挥的功能,我们对缺失虫株的黏附、入侵、胞内生长复制、逸出等方面的影响进行了探究。通过流式细胞仪对三株虫株入侵情况进行计数分析,我们发现基因缺失虫株△ TgRON4-2D10和△ TgRON4-2G8对于宿主细胞入侵的能力显著低于Cas9对照组。进一步的红绿黏附入侵试验分析,通过间接免疫荧光试验,结果显示RON4的缺失并不影响虫体对于宿主细胞的黏附作用,而只对侵入过程具有影响。另一方面,对感染24h的几组虫株每个纳虫空泡内的弓形虫数进行计数分析,结果显示基因缺失组与Cas9对照组差异不显著。最后,利用A23187钙离子载体对三组虫株进行诱导逸出,再进行间接免疫荧光试验,结果发现RON4基因的缺失并不影响虫体从宿主细胞中逸出的能力。最后,对TgRON4基因全长进行克隆,并在目标gRNA序列中进行同义突变。将同义突变TgRON4基因（synoTgRON4）克隆到pBluescript载体中,获得的质粒pBluescript-synoTgRON4-HA质粒转染入△TgRON4-2G8虫株中,经过药物筛选和限制性稀释获得补偿表达单克隆虫株。对synoTgRON4补偿表达虫株、Cas9对照虫株以及△TgRON4-2G8基因缺失虫株的黏附入侵能力进行评价,结果表明,在基因缺失虫株中补偿表达TgRON4之后,虫体的入侵能力有所提高,并恢复至Cas9对照组的水平。本研究通过对TgRON4基因功能的剖析,完善了弓形虫入侵宿主细胞形成的MJ分子机制,为继续研究阻断弓形虫,乃至整个顶复门原虫入侵宿主细胞提供可靠的理论依据。