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目的在急性脑缺血再灌注损伤发生后,不仅会引起脑内神经元发生损伤,而且会引起小胶质细胞发生极化引起炎症反应,释放炎症因子促进神经元细胞的进一步发生损伤,从而加重脑损伤。所以在本课题中主要通过体外缺氧缺糖(OGD)神经元细胞损伤和缺氧缺糖诱导小胶质细胞极化两个方面探讨丹参多酚酸盐的神经保护机制,并结合大脑中动脉阻塞模型(MCAO),验证丹参多酚酸盐(salvia)的治疗效果。方法1.在OGD诱导神经元细胞损伤模型中:首先,OGD不同时间(2h、4h、8h)作用于神经元细胞筛选出最佳缺氧时间。接下来,采用细胞计数方法(CCK-8)测定salvia神经保护的最佳浓度;OGD损伤神经元细胞后,采用激光共聚焦成像技术(CLSM)测定salvia对活性氧簇(ROS)的荧光表达影响。最后,通过Hoechst 33342染色和流式细胞术方法测定了 salvia对神经元细胞核损伤和凋亡的保护作用;同时使用蛋白质印迹实验(Western Blotting)测定salvia作用后神经元细胞内凋亡信号通路(Caspase-3)的表达情况。2.在OGD诱导小胶质细胞极化模型中:首先,OGD不同时间(3h、6h、12 h、24h)作用于小胶质细胞筛选出最佳诱导表型极化时间。接下来,采用CCK-8实验测定salvia对小胶质细胞毒性作用;OGD可以诱导小胶质细胞发生氧化应激,采用CLSM实验方法测定不同浓度salvia对小胶质细胞内ROS和表型极化的荧光表达情况,并且测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)的表达变化;采用Western Blotting检测salvia对小胶质细胞内炎症信号通路(TLR4)的表达情况,并使用采用逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ)的mRNA水平表达情况;采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测炎症因子的蛋白表达水平。最后,采用流式细胞术和Western Blotting方法测定salvia抑制OGD诱导的小胶质细胞活化,从而影响小胶质细胞对神经元细胞的凋亡。3.在大鼠大脑中动脉阻塞模型(MCAO)中:首先,采用TTC染色实验方法测定不同浓度的salvia对大鼠急性脑缺血再灌注损伤的影响。接下来,采用苏木精-伊红(HE)和尼氏(Nissl)染色方法测定salvia作用后的脑切片病理变化;采用激光散斑对比成像方法(LSCI)测定不同实验组中的大鼠脑血流变化情况;采用CLSM实验方法测定不同组小胶质细胞的表型转化情况;TUNEL染色实验检测salvia对于大鼠急性脑缺血再灌注损伤脑内细胞凋亡的影响;采用Western Blotting实验检测脑损伤组织中凋亡通路相关蛋白表达情况。最后,采用Morris水迷宫和Rota-Rod转棒实验测定salvia长期作用于急性脑缺血再灌注损伤后大鼠的认知能力和运动能力的改善情况。结果1.通过一系列实验方法成功构建了 OGD诱导神经元细胞损伤模型。然后使用salvia进行干预OGD诱导的神经元细胞损伤。结果表明:salvia(5μM)能够显著改善OGD诱导的神经元细胞损伤以及降低ROS的表达水平,同时减少损伤神经元细胞中LDH和NO的表达。并且salvia能够显著性减少损伤神经元细胞的凋亡率和抑制Caspase-3凋亡信号通路相关蛋白的表达水平。2.通过一系列实验方法成功构建了 OGD诱导小胶质细胞极化模型。实验结果表明:OGD能够诱导小胶质细胞发生氧化应激反应,导致大量ROS表达,使得小胶质细胞向促炎表型转变,炎症因子TNF-α和IL-6表达含量显著增加,IL-1β,IFN-γ的表达没有变化。接下来将salvia(4 μM,16 μM,64 μM)和小胶质细胞在OGD条件下共孵育,随着salvia浓度的增加,OGD诱导小胶质细胞中ROS的表达含量逐渐减少,并且抗氧化酶SOD,CAT,GHS-px的表达含量也逐渐降低。然后采用荧光染色观察小胶质细胞的表型,salvia与小胶质细胞共孵育后,促炎表型抗体CD86的表达含量逐渐降低。Salvia可降低OGD诱导的小胶质细胞中TLR4信号通路的激活,减少炎症因子TNF-α和IL-6的mRNA与蛋白表达的水平。最后,将salvia和小胶质细胞在OGD条件下共孵育制备的条件培养基作用与神经元细胞,结果发现salvia条件培养基能够提高神经元细胞的活力,减少凋亡率,抑制神经元细胞Caspase-3信号通路的激活。3.在MCAO模型中,实验结果发现salvia(20mg/kg)能够有效的减少大鼠脑梗死面积,增加神经元细胞的有序性,血脑屏障的完整性得到部分修复。并且能够减少小胶质细胞的活化。TUNEL染色结果也发现,salvia可以减少凋亡小体的表达,Caspase-3凋亡通路相关蛋白表达显著性减少。通过Morris水迷宫和Rota-Rod转棒实验测定salvia长期作用,发现可以改善急性脑缺血再灌注损伤后大鼠的认知能力和提高大鼠运动能力。结论本课题主要从两个方面探讨salvia的药理活性:一方面是通过构建OGD诱导神经元损伤模型,发现salvia可以减少神经元细胞内ROS的表达,进而抑制Caspas-3信号通路的激活。另一方面是通过OGD诱导小胶质细胞的极化模型,发现salvia减少小胶质细胞内氧化应激反应,降低ROS的表达,进一步抑制TLR4信号通路的激活,从而减弱由小胶质细胞极化带来的神经损伤。同样在动物水平得到了进一步验证,这些结果说明salvia能够有效的减少急性脑缺血再灌注损伤,具有较好的神经保护作用。