【摘 要】
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目的:探讨在小鼠Th9细胞中上调miRNA-145对细胞分化及相关因子IL-9表达的影响。方法:利用初始CD4+T细胞（Naive CD4+T cell）分选试剂盒从小鼠脾脏分离Naive CD4+T cell,应用流式细胞术检测分选后Naive CD4+T cell的纯度。Naive CD4+T cell随机设置为诱导组、对照组,用鼠抗CD3抗体（Anti-Mouse CD3e）及鼠抗CD28抗
【基金项目】
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项目名称:microRNA-143/145调控Th9细胞抑制恶性腹腔积液的机制研究,项目合同编号:No.31560257,项目来源:国家自然科学基金,项目起止时间:2016.01-2019.12; 项目名称:IFN-γ/MACC1/MMP1信号轴促进胰腺癌侵袭转移的作用及分子机制研究,项目合同编号:No.81960439,项目来源:国家自然科学基金,项目起止间:2020.01-2023.12
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目的:探讨在小鼠Th9细胞中上调miRNA-145对细胞分化及相关因子IL-9表达的影响。方法:利用初始CD4+T细胞（Naive CD4+T cell）分选试剂盒从小鼠脾脏分离Naive CD4+T cell,应用流式细胞术检测分选后Naive CD4+T cell的纯度。Naive CD4+T cell随机设置为诱导组、对照组,用鼠抗CD3抗体（Anti-Mouse CD3e）及鼠抗CD28抗体（Anti-Mouse CD28）刺激Naive CD4+T细胞活化,诱导组细胞培养液中加入白介素4（IL-4）、转录生长因子β（TGF-β）向Th9极化,对照组则在不添加诱导物的培养基中培养,经过3天的分化培养,采用流式细胞术分别检测两组Th9细胞的标记物CD4+IL9+表达比例。分选后的Naive CD4+T cell随机设置为实验组、对照组和空白组,利用Trans IT-TKO试剂分别对各组细胞进行转染,其中实验组转染miRNA-145模拟物（miR-145-5p mimic）,对照组转染miRNA-145模拟物阴性对照（miR-145-5p mimic Negative Control）,空白组不转染,24h后使用RT-PCR测定各组细胞miR-145的转染效率和NFATc1 mRNA的水平,在转染后的各组细胞培养液中加入IL-4、TGF-β诱导其向Th9细胞分化,72h后采用流式细胞术分别测定各组细胞中Th9的表达比例;用ELISA检验各组细胞培养上清液IL-9的分泌量;用RT-PCR分别检测各组细胞Smad3、IL-9的mRNA表达水平。结果:通过流式细胞术检测分选后的Naive CD4+T cell比例为（91.4±2.7）%,成功获得高纯度的初始CD4+T细胞。经过3天的分化培养后,诱导组CD4+IL9+细胞比例为10.9±2.0%,高于对照组2.22±0.2%（P<0.05）,差异具有统计学意义,Th9细胞诱导成功。分别转染各组细胞24h后,RT-PCR检验显示,与miR-145 mimic NC组及空白组相比,miR-145 mimic组细胞的miR-145表达水平显著增高（P<0.01）,差异具有统计学意义,转染成功;与miR-145 mimic NC组相比,转染miR-145 mimic组细胞NFATc1的mRNA表达水平降低（t=-4.932,P<0.01）,差异具有统计学意义。细胞转染后在Th9诱导条件下继续分化培养3天,流式细胞术检测显示与miR-145mimic NC组和空白组相比,miR-145 mimic组的CD4+IL9+细胞的比例降低（P<0.05）,差异具有统计学意义;ELISA检测显示与miR-145mimic NC组和空白组相比,miR-145 mimic组的细胞上清IL-9水平显著降低（P<0.01）,差异具有统计学意义;RT-PCR检测显示,与miR-145mimic NC组和空白组相比,miR-145 mimic组细胞IL-9的mRNA表达水平降低（P<0.05）;与空白组相比,miR-145 mimic组细胞Smad3的mRNA表达水平下降（P0.05）,差异无统计学意义。结论:在IL-4、TGF-β诱导初始CD4+T细胞为Th9细胞过程中,过表达初始CD4+T细胞的miR-145可抑制Th9细胞的分化,并抑制IL-9、NFATc1、Smad3的mRNA表达,并抑制细胞IL-9的分泌水平。本研究结果展示了miRNA-145对Th9细胞的抑制作用,为进一步研究在恶性腹腔积液免疫微环境中miRNA-145参与Th9的肿瘤免疫调控及相关机制提供了理论基础。
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