【摘 要】
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圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)是分离自中国东北土壤的一株尼可霉素产生菌.尼可霉素是一类核苷肽类抗生素,由于其结构与几丁质合成酶的天然底物UDP-N-乙酰葡
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圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)是分离自中国东北土壤的一株尼可霉素产生菌.尼可霉素是一类核苷肽类抗生素,由于其结构与几丁质合成酶的天然底物UDP-N-乙酰葡萄糖胺类似,是该酶的强竞争性抑制剂,是一类很有开发前景的新型的农业用和医用抗真菌抗生素.该论文对实验室前期克隆的与尼可霉素生物合成相关的基因sanO和sanN的功能进行了研究:1.sanO基因大小为2034-bp,GenBank登录号为AY188796;其编码产物与多种细菌非核糖体肽合成酶同源性较高,采用双交换基因破坏策略进行了功能研究.生物活性检测表明sanO阻断突变株抑制真菌生长的能力明显低于野生型,HPLC分析显示sanO阻断突变株丧失了尼可霉素X组分的合成能力,但是尼可霉素Z组分的产量几乎保持不变.互补试验结果表明,在互补株中,抑制真菌生长的能力和尼可霉素X的合成能力都得到了恢复,说明sanO基因对尼可霉素X合成是必需的;巴比妥酸检测进一步确定sanO基因参与了尼可霉素X组分的碱基4-甲基-4-咪唑-2-酮的合成;引物延伸实验确定了sanO基因的转录起始位点是位于起始密码子(GTG)上游87-bp处的G碱基.2.通过增加尼可霉素X合成必需基因sanO在圈卷产色链霉菌野生型中的拷贝数,构建了该组分的高产工程菌.生物活性检测表明工程菌抑制真菌生长的能力明显高于野生型;进一步对工程菌和野生型菌株的发酵液进行了HPLC分析,结果表明工程菌中尼可霉素X的产量约为1200mg/L,约为野生型的2倍;RT-PCR分析表明工程菌中sanO基因的转录水平也高于野生型.3.sanN基因是该实验室前期克隆的与尼可霉素生物合成相关的基因,大小为891-bp,GenBank登录号为AY188795.同源性比较表明sanN基因的编码产物(296aa)与乙醛脱氢酶存在较高的同源性.采用双交换基因阻断的策略,构建了sanN基因的阻断突变株,生物活性检测表明sanN破坏株丧失了抑制真菌生长的能力,HPLC分析表明sanN突变株不能合成尼可霉素Z和X.互补试验结果表明,在互补株中,抑制真菌生长的能力以及尼可霉素Z和X的合成能力都得到了恢复,说明sanN基因对尼可霉素合成是必需的;巴比妥酸检测显示,sanN的阻断可能导致尼可霉素肽基部分的合成异常,导致突变株不能合成任何有生物活性的尼可霉素组分;此外,引物延伸实验揭示,sanN基因具有两个启动子,它们的转录起始位点分别是起始密码子(ATG)上游34-bp的A(P<,san/N1>)和79-bp的C(P<,san/N2>).
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