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背景与目的:巨噬细胞吞噬并破坏颗粒物,这是重要的机体防御机制。巨噬细胞吞噬过程中会发生肌动蛋白细胞骨架的重塑,从而产生独特的富含F-肌动蛋白(F-actin)的膜结构,称为吞噬杯。吞噬杯是一种杯状的细胞膜内陷,在吞噬过程中其远端边缘闭合形成吞噬体。通过其边缘沿颗粒表面的行进,该吞噬杯包围并通过吞噬体膜与细胞膜的分离最终包裹颗粒。白细胞分化抗原36(CD36)是B类清道夫受体家族的成员,可在多种细胞上表达。当前的工作表明,在巨噬细胞吞噬过程中,CD36通过调节肌动蛋白聚合来调控巨噬细胞的扩散,迁移和粘附。但是,尚不清楚CD36是否参与吞噬杯形成的调节。因此,本研究旨在探讨CD36参与吞噬的潜在机制。方法:第一部分:体内吞噬试验,给CD36野生型(CD36WT),CD36敲低(CD36KD)和CD36敲除(CD36KO)小鼠(6-8周)腹腔注射1.0 ml液体石蜡。6天后,将表达绿色荧光蛋白(GFP)的大肠杆菌(E.coli)或CFSE标记的红细胞(RBC)注射入小鼠的腹腔。2小时后收获总腹腔细胞,用PE-F4/80抗体标记原代腹腔巨噬细胞,并通过流式细胞术检测吞噬作用。吞噬杯的检测,将分离的小鼠腹腔巨噬细胞接种到共聚焦皿中,培养过夜使其粘附,纯化。将CFSE标记的红细胞加入共聚焦皿,与巨噬细胞在37℃共孵育2小时,将细胞用Phalloidin-iFluor 647试剂染60分钟,共聚焦显微镜观察吞噬杯的形成。第二部分:用靶向CD36(CD36i)或阴性对照siRNA(NCi)的小干扰RNA转染THP-1细胞,12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇(PMA)(100nM)诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞,构建CD36干扰的巨噬细胞模型。用Western blot法鉴定CD36的干扰效果。大肠杆菌或红细胞与巨噬细胞共孵育2小时,用Western blot法检测细胞c-Jun氨基末端激酶(JNK),细胞外调节蛋白激酶(ERK)的磷酸化水平。使用或不使用JNK激动剂茴香霉素(anisomycin)(1μM)预处理细胞24小时,将CFSE标记的红细胞加入共聚焦皿,与巨噬细胞共孵育2小时,Phalloidin-iFluor 647试剂染色,共聚焦显微镜观察吞噬杯的形成;再将大肠杆菌或红细胞与巨噬细胞共孵育2小时,流式细胞术检测细胞吞噬情况。大肠杆菌或红细胞与CD36干扰的巨噬细胞共孵育2小时,用Western blot法检测巨噬细胞总的Lyn激酶(Lyn)的表达。使用Lyn激动剂托利咪酮(tolimidone)(3μM)预处理巨噬细胞12小时,将大肠杆菌或红细胞与巨噬细胞共孵育2小时,用Western blot法检测细胞JNK的磷酸化水平。使用或不使用托利咪酮(3μM)预处理巨噬细胞12小时,将CFSE标记的红细胞加入共聚焦皿,巨噬细胞共孵育2小时,Phalloidin-iFluor 647试剂染色,共聚焦显微镜观察吞噬杯的形成;再将大肠杆菌或红细胞与巨噬细胞共孵育2小时,流式细胞术检测细胞吞噬情况。结果:第一部分:与CD36WT组相比,CD36KD和CD36KO组中摄取大肠杆菌或红细胞的巨噬细胞百分比降低(P<0.05);CD36KD和CD36KO巨噬细胞的GFP或CFSE的平均荧光强度(代表巨噬细胞摄取的大肠杆菌或红细胞的数量)都是显著降低的(P<0.05)。与CD36WT巨噬细胞相比,CD36KD和CD36KO巨噬细胞形成的吞噬杯的数量明显减少。此外,CD36WT巨噬细胞中F-actin与红细胞的Pearson相关性高于CD36KD和CD36KO巨噬细胞(P<0.05)。第二部分:THP-1细胞中CD36的表达被其siRNA转染抑制,抑制效率达到60%(P<0.05)。Western blot结果显示,吞噬大肠杆菌或红细胞的过程中,与对照组相比,CD36i组JNK磷酸化明显降低(P<0.05),ERK磷酸化无显著差异。进一步,在无茴香霉素时,CD36干扰可以显著减少吞噬杯的形成和巨噬细胞吞噬;茴香霉素处理后,抑制CD36不能诱导吞噬杯形成和吞噬的减少(P<0.05)。Western blot结果显示CD36干扰后吞噬过程中Lyn表达水平较对照组明显降低(P<0.05)。进一步,托利咪酮处理后,CD36下调诱导的JNK磷酸化的降低消失了(P<0.05)。在无托利咪酮时,CD36干扰可以显著减少吞噬杯的形成和巨噬细胞吞噬;托利咪酮处理后,CD36抑制不能诱导吞噬杯形成和吞噬的减少(P<0.05)。结论:1、CD36敲低和CD36敲除都会显著减少吞噬杯的形成及巨噬细胞吞噬。2、抑制CD36通过抑制Lyn/JNK通路减少吞噬杯的形成,从而降低巨噬细胞吞噬。JNK激动剂茴香霉素和Lyn激动剂托利咪酮可显著改善CD36低表达诱导的巨噬细胞吞噬的减少。