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结核病（Tuberculosis,TB）是一种主要由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M.tuberculosis）感染引起的传染性疾病。预防和控制结核分枝杆菌感染的最佳方式是接种有效的疫苗。卡介苗（Bacille Calmette-Guerin,BCG）虽然能有效保护儿童免于结核分枝杆菌感染,但是随着年龄的增加,其保护效果不断下降。因此,为了控制结核病,我们需要应用当前的研究技术开发更有效的结核疫苗。本实验室前期制备了包括EAMM(ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4)、LT69(ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Hsp X)和LT70(ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c)等包含结核分枝杆菌不同阶段抗原的融合蛋白,并与DP佐剂联合制成了蛋白亚单位疫苗。攻毒实验结果显示,接种这些疫苗的小鼠相比于接种BCG的小鼠,体内细菌载量明显更低。这提示将结核分枝杆菌不同阶段抗原组合成融合蛋白可能是一种开发有效结核疫苗的方式。抗原ESAT6和CFP10主要存在于致病性结核分枝杆菌中,是由BCG缺失区（region of deletion,RD）基因编码的早期分泌蛋白质。抗原Rv1738则是本实验室前期筛选中,保护效果较好的一种潜伏期抗原。目的:本研究以p ET30a（+）质粒作为表达载体,拟构建包含ESAT6、CFP10及Rv1738抗原的无标签融合蛋白ESAT6-CFP10-Rv1738（简称LT33）。制备纯度大于95%的融合蛋白LT33,并在小鼠模型中评价融合蛋白LT33与DDA-Poly I:C（简称DP）佐剂联合后诱导小鼠细胞免疫和体液免疫应答的能力。方法:1.融合蛋白LT33的构建和表达。通过PCR从p ET30a（+）-ESAT6-CFP10重组质粒中扩增表达ESAT6-CFP10融合蛋白的基因,并将其插入到含克隆位点的p ET30a（+）-CFP10-Rv1738质粒中,替换表达CFP10抗原的基因,构建p ET30a（+）-ESAT6-CFP10-Rv1738重组质粒,将重组质粒转化入大肠埃希菌BL21（DE3）中表达融合蛋白LT33。无标签融合蛋白LT33分别通过硫酸铵沉淀、离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤层析等方式进行纯化。2.LT33/DP亚单位疫苗的免疫原性检测。将融合蛋白LT33和DP佐剂混合制成亚单位疫苗。将6-8周龄的SPF级雌性C57BL/6小鼠随机分为PBS组、BCG组、LT33蛋白组和LT33/DP组,每组10只。在第0、2、4周分别进行免疫接种,其中PBS组仅在第0周注射200μL PBS,BCG组仅在第0周免疫接种200μL BCG（约5×106CFU）,LT33蛋白组和LT33/DP组在第0、2、4周分别免疫接种200μL LT33蛋白和LT33/DP（各含10μg融合蛋白LT33）。在末次免疫6周后检测疫苗的免疫原性,通过间接ELISA法检测小鼠血清中ESAT6、CFP10和Rv1738抗原特异性Ig G、Ig G1和Ig G2c抗体滴度。无菌分离的小鼠脾脏淋巴细胞,在分别经ESAT6、CFP10和Rv1738抗原在体外刺激后,通过流式细胞术检测抗原特异性IFN-γ和IL-2的表达水平。3.单克隆抗体的制备。将融合蛋白LT33与DP佐剂联合使用,免疫BALB/c小鼠三次,腹腔加强注射纯蛋白一次。末次免疫3天后,分离小鼠脾脏淋巴细胞,并将其与SP2/0细胞通过PEG3350进行融合。经间接ELISA筛选分泌ESAT6、CFP10和Rv1738抗原特异性单克隆抗体的细胞株。结果:1.融合蛋白LT33的构建和表达。通过分子克隆技术最终成功构建了p ET30a（+）-ESAT6-CFP10-Rv1738重组质粒。融合蛋白LT33在大肠埃希菌BL21（DE3）中主要以可溶性蛋白的形式表达,分子量为32453.5Da。蛋白上清经硫酸铵沉淀初步纯化后,融合蛋白LT33依然保持了良好的可溶性,并且能去除大部分的杂蛋白。再依次使用Hi Trap Q HP离子交换层析柱和Hi Load 16/600Superdex 75 pg凝胶过滤层析柱进行精细纯化。最终,得到了纯度大于95%的融合蛋白LT33。2.LT33/DP亚单位疫苗的免疫原性检测。亚单位疫苗LT33/DP免疫C57BL/6小鼠3次后,与BCG组和纯LT33蛋白组相比,LT33/DP组小鼠血清中ESAT6、CFP10和Rv1738抗原特异性Ig G、Ig G1和Ig G2c抗体滴度明显更高（P<0.05）。在ESAT6、CFP10和Rv1738抗原刺激后,LT33/DP组小鼠脾脏CD4+IFN-γ+T细胞、CD4+IL-2+T细胞以及CD8+IFN-γ+T细胞的比例也明显高于BCG组和LT33蛋白组（P<0.05）。3.单克隆抗体的制备。亚单位疫苗LT33/DP免疫BALB/c小鼠3次后,通过杂交瘤技术获得了4株稳定分泌单克隆抗体的细胞株。其中1H3可以特异性识别ESAT6抗原,3C9和4C10能识别Rv1738抗原,4A5则能识别CFP10抗原。在体外大量培养杂交瘤细胞后,通过Protein A层析柱从培养上清中分离出了纯度较高的单克隆抗体。结论:融合蛋白LT33在BL21（DE3）中主要以可溶性表达为主。依次通过硫酸铵沉淀,离子交换层析和凝胶过滤层析制备了纯度高于95%的融合蛋白LT33。LT33联合DP佐剂接种C57BL/6小鼠后,可同时对ESAT6、CFP10和Rv1738抗原产生抗原特异性细胞免疫和体液免疫,具有较好的免疫原性。在BALB/c小鼠接种LT33/DP后,通过将小鼠脾脏淋巴细胞与SP2/0细胞融合,成功筛选获得了表达ESAT6、CFP10和Rv1738抗原特异性抗体的杂交瘤细胞株。