【摘 要】
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目的:探究CTGF联合人前交叉韧带成纤维细胞Transwell共培养体系对ScxhAMSCs体外向韧带细胞分化的影响。方法:1)通过酶消化法从胎盘羊膜上分离出hAMSCs并进行传代培养,取传至第3代的hAMSCs进行细胞表型鉴定,检测hAMSCs向骨、软骨及脂细胞定向分化的能力。运用酶消化法从人前交叉韧带残端分离出hACLFs,免疫荧光染色检测I型胶原、III型胶原表达情况;通过CCK-8法比较h
【基金项目】
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贵州省科技厅（黔科合支撑[2017]2882）
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目的:探究CTGF联合人前交叉韧带成纤维细胞Transwell共培养体系对ScxhAMSCs体外向韧带细胞分化的影响。方法:1)通过酶消化法从胎盘羊膜上分离出hAMSCs并进行传代培养,取传至第3代的hAMSCs进行细胞表型鉴定,检测hAMSCs向骨、软骨及脂细胞定向分化的能力。运用酶消化法从人前交叉韧带残端分离出hACLFs,免疫荧光染色检测I型胶原、III型胶原表达情况;通过CCK-8法比较hAMSCs与hACLF的增殖能力。2)将目标质粒和对照质粒共同转染到HEK293T细胞,包装慢病毒后进行浓缩,进行滴度测定后对第3代hAMSCs进行转染,q PCR及Westen Blot对转染后的细胞进行Scx过表达验证。3)联合使用CTGF及Transwell共培养体系进行诱导分化,按不同培养方案分为6组:（A）hAMSCs经CTGF诱导组、（B）hAMSCs+hACLFs Transwell共培养组、（C）Scx-hAMSCs组、（D）Scx-hAMSCs经CTGF诱导组（E）ScxhAMSCs+hACLFs Transwell共培养组（F）Scx-hAMSCs经CTGF诱导+hACLFs Transwell共培养组。共培养组中两组细胞密度比为1:1。CCK-8法测定各组细胞增殖能力,分别于7、10、14天时对各组细胞的韧带相关基因和蛋白表达进行检测。结果:1)运用酶消化法得到的hAMSCs数目多,呈梭形贴壁生长,旋转排列;细胞表型符合间充质干细胞的细胞表型特点,经定向诱导后可成骨、软骨、脂细胞分化,具备三系分化能力,符合MSCs特点。酶消化法提取的原代hACLFs数目较少,经传代扩增后呈长梭型规则排列;免疫荧光染色结果提示有Ⅰ、Ⅲ型胶原表达;CCK-8检测结果表明hAMSCs体外增殖能力明显强于hACLFs,差异具有统计学意义（P＜0.05）。2)将构建的质粒转化扩增后进行内毒素提取,各自与Lenti-Mix混合,制备Lenti-Mix-DNA转染系统,感染HEK293T细胞,包装成慢病毒。将慢病毒浓缩后感染hAMSCs,q PCR和Westen Blot结果均显示Scx过表达组细胞中SCX表达显著高于空载组（P＜0.05）。3)CCK-8结果表明使用CTGF诱导后的实验组细胞增殖水平显著高于其他组（P＜0.05）。免疫荧光检测结果提示各组Ⅲ型胶原、纤粘蛋白表达水平与时间呈正相关,其中CTGF联合共培养组14d时Ⅲ型胶原、纤粘蛋白表达更高。q PCR结果显示在14d时,各组Ⅲ型胶原、纤粘蛋白的m RNA表达显著上调（P＜0.05）,CTGF组及共培养组m RNA表达高于Scx-hAMSCs组。Western blot结果示同一时间点共培养组I型、III型胶原蛋白表达量高于hAMSCs经CTGF诱导组及Scx-hAMSCs组。苦味酸天狼猩红染色显示,14d时各组胶原沉积明显增多,Scx-hAMSCs经CTGF诱导共培养组内的胶原分泌量更多。结论:1)hAMSCs具备MSCs的表型特点,具备三系分化能力,体外增殖能力较hACLFs强。2)慢病毒载体可将Scx基因转染至hAMSCs,并在宿主细胞中过表达。3)CTGF与Transwell共培养系统在促进hAMSCs向韧带细胞分化上具有协同作用,二者联合使用效果优异;其中CTGF在维持细胞活性、促进细胞增殖方面效果更好,Transwell共培养在诱导细胞分化上作用更强。
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