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研究背景及科学问题生物体的生长和代谢同时受生长因子和其他激素的调控,它们的活性由相应的受体介导。昆虫生命成长周期主要受三种激素调控,分别为蜕皮激素(20E)、保幼激素(JH)和胰岛素样生长因子(insulinlikepeptide,Ilps)。其中胰岛素信号通路主要控制成长发育,而20E和JH相互作用控制蜕皮变态信号。胰岛素调控幼虫生长达到临界体重,之后释放促前胸腺激素(PTTH)促进蜕皮激素的合成与释放,最后于组织加工成活性代谢物20E。在果蝇中,insulin由胰岛β细胞合成,刺激组织及PG的生长,使PG分泌大量20E,启动变态发育。果蝇中,20E通过促进转录因子dFOXO(ForkheadboxO,FoxO)的核定位和翻译抑制因子4E-BP的转录,对抗胰岛素促进生长的作用。家蚕中,20E对受体复合物EcRB1/USP1及insulin受体在不同的生理条件下有不同的调控作用。棉铃虫的前期研究结果表明,存在一种细胞周期蛋白依赖性激酶调节亚基1(CKS1)受20E和insulin共同调节,保证虫体生长和变态,insulin上调CKS1表达,而高浓度20E则抑制CKS1表达。另外发现一种GTP酶-Rab4b介入20E和insulin通路的相关基因的转录调控。20E可以上调磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸3-磷酸酶(Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate3-phosphatase,PTEN)和叉头框蛋白FoxO的表达,同时PTEN可以通过抑制AKT磷酸化实现抑制FoxO磷酸化,导致FoxO的核定位,实现对胰岛素途径的拮抗。以上研究均表明20E参与胰岛素途径调节,但尚不清楚具体作用机制。本论文以鳞翅目昆虫棉铃虫为模型,选择胰岛素受体IR为靶标,通过激素刺激、双链RNA干扰、构建过表达质粒等实验技术,研究20E对IR的调控,阐明20E调控胰岛素信号途径的分子机制,为害虫的防治提供理论依据和靶标基因。研究结果及结论虫体双链RNA干扰IR,与对照组比,实验组出现高死亡率、化蛹时间延迟及化小蛹等表型。虫体干扰IR后检测到胰岛素通路下游相关基因受到表达抑制。在虫体的发育阶段,IR表达量在取食期高,蜕皮变态期下降。虫体组织和棉铃虫表皮细胞系上,insulin以浓度和时间依赖的方式上调IR表达。而20E则是依赖浓度梯度双向调节IR表达,低浓度20E促进IR表达,高浓度20E抑制IR表达。在HaEpi细胞系上叠加insulin和不同浓度的20E刺激后得到相同结果,低浓度20E促进insulin诱导的IR表达和磷酸化,而高浓度20E抑制insulin诱导的IR表达和磷酸化。Ilps在棉铃虫幼虫到蛹的发育时期均有表达,并且在末龄幼虫和蛹期呈现上调表达趋势,说明末龄幼虫和蛹期20E不是通过抑制IPs的表达来抑制IR磷酸化的。放线菌酮及专门抑制磷酸酶的一种抑制剂预处理细胞后发现高浓度20E抑制IR磷酸化现象减弱,意味着高浓度20E使IR发生去磷酸化是通过上调一种磷酸酶完成。在细胞系干扰PTEN后,高浓度20E抑制IR磷酸化效果减弱,单独过表达PTEN可以引起IR去磷酸化,说明高浓度20E通过上调PTEN使IR去磷酸化,但没有检测到20E诱导下PTEN与IR互作,推测PTEN间接调控IR磷酸化。研究得出如下结论:胰岛素信号通路由IR介导调节幼虫生长和发育,insulin上调控IR表达和磷酸化。高浓度20E促进Ips表达,高浓度20E通过上调PTEN表达抑制IR磷酸化。以上机制研究表明20E基于浓度促进或抑制IR的表达及磷酸化,参与胰岛素信号通路调控。创新性及意义本论文首次发现20E依赖浓度双向调控IR表达和磷酸化参与胰岛素信号通路调控,为20E和胰岛素共同调控棉铃虫生长发育提供了新的数据支持。