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乳腺癌是全世界发病率和死亡率最高的妇科恶性肿瘤,严重威胁女性的健康与生命。临床治疗中面临的最大挑战是治疗药物的耐药性问题,约有一半的患者在起初有效的化疗之后慢慢出现药物耐受,从而导致治疗失败。组蛋白去乙酰化作为一种重要的表观遗传修饰,参与了许多恶性肿瘤的发生发展。HDAC 1是目前为止发现的与肿瘤关系最密切的组蛋白去乙酰化酶,与细胞周期、分化、增殖和有丝分裂等生物过程调节关系紧密。但有关HDAC 1与乳腺癌化疗耐药的作用机制尚不清楚,亦未见研究报道。本实验拟建立HDAC1过表达慢病毒载体,构建HDAC 1稳定过表达的乳腺癌MCF-7细胞系,观察HDAC 1过表达对MCF-7细胞耐药程度的改变,评价HDAC 1的稳定过表达的MCF-7细胞对化疗药物的抗凋亡作用及凋亡相关蛋白的表达情况,为提高化疗效果、减少化疗药物用量奠定基础。目的:研究HDAC 1的过表达的MCF-7细胞对化疗药物的抗凋亡作用,探讨其与乳腺癌化疗耐药的关系。方法:1.HDAC 1基因过表达重组慢病毒载体的构建及鉴定构建包含HDAC 1基因的过表达慢病毒载体并进行鉴定,包装出慢病毒,转染MCF-7细胞建立HDAC 1稳定过表达的MCF-7细胞系,Western blot检测HDAC 1蛋白表达情况。构建HDAC 1过表达慢病毒载体通过从乳腺癌细胞系中提取总RNA,RT-PCR、TA克隆、酶切鉴定及测序分析鉴定HDAC 1基因,将HDAC 1与pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro慢病毒载体连接,包装病毒,感染乳腺癌细胞系MCF-7,嘌呤霉素筛选,建立HDAC1稳定过表达的MCF-7细胞系。2.HDAC 1过表达对乳腺癌细胞系化疗药物耐药程度的影响探讨HDAC 1过表达MCF-7细胞与肿瘤化疗耐药的关系,实验细胞MCF-7-HDAC 1和MCF-7-Control细胞分为未施加药物对照组(Control组)、VM-26(替尼泊苷)、DDP(顺铂)及THP(吡柔比星)组,共4组。对照组加入含10%FBS的DMEM培养基;VM-26组设置终浓度为0.39、0.78、1.56、3.12μg/mL的4个药物浓度梯度,作用48 h;DDP组设置终浓度为0.3125、0.625、1.25、2.5 μg/mL的4个浓度梯度,作用48 h。THP组设置终浓度为0.39、0.78、1.56μg/mL的3个浓度梯度,作用72 h。通过MTT检验MCF-7细胞耐药性的改变;Hoechst33258/PI双染色、流式AnnexinV/PI检测HDAC1过表达MCF-7细胞的凋亡率;Western blot检测Bcl-2/Bax、Caspase 3表达,研究HDAC 1 过表达MCF-7细胞化疗对药物耐受程度的改变,并初步探讨其作用机制。结果:1.HDAC1基因过表达重组慢病毒载体的构建及鉴定扩增HDAC 1基因并构建了 pCDH-CMV-MCS-HDAC l-EF1-Puro慢病毒表达质粒体,成功建立HDAC1稳定过表达的MCF-7细胞系,Western blot检测能够过表达HDAC 1。2.HDAC 1过表达对乳腺癌细胞系化疗药物耐药程度的影响给予VM-26、DDP、THP处理MCF-7细胞后,可浓度依赖性地降低MCF-7细胞存活率(P<0.05,P<0.01 或 P<0.001),与 MCF-7-Control细胞相比,VM-26、DDP、THP各浓度下MCF-7-HDAC 1细胞的存活率明显较高,MCF-7-HDAC 1与 MCF-7-Control 细胞 IC50(半数抑制浓度)分别为(18.861 vs 14.906,18.310 vs 11.589,8.225 vs 5.144);Hoechst 33258/PI双染观察到三种药物促使细胞核凝聚固缩,使细胞碎片增多,细胞死亡增多,与MCF-7-Control细胞相比,HDAC1过表达MCF-7细胞核固缩凝聚减轻,细胞死亡数减少;而流式FITC-Annexin V/PI双染观察到三种药物处理MCF-7细胞细胞凋亡率浓度依赖性升高(P<0.05,P<0.01 或 P<0.001),与 MCF-7-Control 细胞相比,凋亡率明显降低(P<0.05,P<0.01或P<0.001),具有统计学差异;Westernblot结果显示,随着三个药物组浓度的增加,MCF-7细胞Bcl-2蛋白表达减少,Bax蛋白表达逐渐增多,Bcl-2/Bax比值明显降低(P<0.05,P<0.01 或 P<0.001),Caspase 3 表达明显增加(P<0.05,P<0.01或 P<0.001),与 MCF-7-Control 细胞相比,MCF-7-HDAC 1 细胞 Bcl-2/Bax 比值显著性增加(P<0.001),Caspase 3 表达明显降低(P<0.05,P<0.01 或 P<0.001)。结论:1.成功构建了HDAC 1慢病毒重组表达载体,建立HDAC 1稳定过表达的MCF-7细胞系。2.HDAC 1的过表达具有提高MCF-7细胞化疗后药物存活率,降低VM-26、DDP、THP等抗肿瘤药物所致的凋亡作用。3.在所选用的VM-26(替尼泊苷)、DDP(顺铂)及THP(吡柔比星)3种化疗药物的各个浓度作用下,与MCF-7-Control细胞相比,HDAC 1过表达增加MCF-7细胞caspase 3表达,减少Bcl-2/Bax蛋白的表达,说明HDAC 1的过表达可能通过上调Bcl-2/Bax蛋白表达,下调Caspase 3蛋白表达来诱导MCF-7细胞的化疗耐药。