益生菌是通过改善宿主或环境的相关微生物群落,提高饲料利用或其营养价值,增强宿主对疾病的反应或改善周围环境质量,对宿主产生有益作用的活的微生物添加剂。水产养殖中,鱼类经常受到各种外界不良应激,导致生长受阻,严重时导致鱼病爆发,甚至死亡,这严重影响了水产食品安全及水产养殖发展。因此,提高鱼体免疫力、同时减少病害极为重要。面对环境对水产动物造成的不良危害,通常使用化学药物或抗生素,易造成机体药物残留、耐药性增强、免疫力下降、微生态失调以及致畸、致癌、环境污染等一系列不良后果。益生菌作为饲料添加剂是抗生素的良好替代品,在水产动物饲料中添加一定量的益生菌,能够调节机体平衡与生理功能、提高消化吸收能力、促进水产动物生长、提高机体特异性和非特异性免疫力、提高机体抗菌抗病毒等能力。因此益生菌作为饲料添加剂越来越受到重视,应用也日益广泛,具有十分广阔的前景。异育银鲫（Carassius auratus gibelio）,是我国一种重要的养殖鱼类,具有生长速度快、耐低氧、肉质鲜嫩、营养丰富等特点。在养殖中异育银鲫极易受到外界因素影响产生应激胁迫,如应激性出血、体表粘液减少、摄食下降等现象。鉴于此,以异育银鲫为研究对象,以凝结芽孢杆菌诱导异育银鲫为研究的切入点,日粮补充凝结芽孢杆菌,通过常规营养学、高通量转录组及miRNA测序以及生物信息学分析,阐明凝结芽孢杆菌对异育银鲫保护作用的分子调控及表观遗传机制,以期解决凝结芽孢杆菌作为免疫增强剂的未知困境,为凝结芽孢杆菌在异育银鲫饲料中的使用提供理论依据。研究内容主要分为以下六个部分:1、凝结芽孢杆菌对异育银鲫生长及生理健康的影响通过设计不同凝结芽孢杆菌含量（0、125、250、500和1000 mg/kg）的配合饲料,经8周养殖试验,通过生长、消化酶活性、免疫因子、抗氧化酶活性及抗病原菌感染等评价指标,探讨不同水平凝结芽孢杆菌对异育银鲫的影响。发现250-500 mg/kg凝结芽孢杆菌显著提高了异育银鲫的增重率（WGR）,显著降低了饵料系数（FCR）;显著提高了肠道蛋白酶和淀粉酶活性;显著提高了溶菌酶、爆发活性、抗肿瘤坏死因子（TNF-α）、超氧化物歧化酶（SOD）和抗超氧阴离子（ASAFR）活性,显著降低了丙二醛（MDA）含量;显著降低了感染嗜水气单胞菌后异育银鲫的累计死亡率;显著提高了应激蛋白HSP70的表达。结果表明,凝结芽孢杆菌可有效提高异育银鲫的生长性能,提高异育银鲫的代谢、免疫及抗氧化性能,提高抗病原菌感染能力。2、凝结芽孢杆菌作用于异育银鲫的转录组学分析利用高通量测序技术对凝结芽孢杆菌含量为0（BC0）和500 mg/kg组（BC500）异育银鲫肝脏进行转录组测序,通过生物信息学分析,挖掘潜在的差异表达基因,以期探索凝结芽孢杆菌作用于异育银鲫的关键调控通路。结果显示,共鉴定BC500组差异表达基因1969个,其中上调1226个,下调743个;差异基因GO富集分析发现,差异基因主要富集到氧化还原反应、蛋白分解和代谢、生物膜、MHC抗原合成及转导等生命过程等过程;KEGG富集分析发现,差异基因主要富集代谢、细胞响应、遗传信息传递和生物体系统等生命过程,主要与胰岛素信号、胞吞作用、吞噬体、细胞粘附分子、PPARs信号和脂肪酸合成等信号通路。结果表明,凝结芽孢杆菌对异育银鲫蛋白及脂肪代谢、免疫功能及细胞信号转导产生调控作用。深入分析发现,凝结芽孢杆菌诱导的差异基因主要影响代谢及免疫功能,Nrf2-Keap1信号通路被激活,该信号参与了凝结芽孢杆菌诱导的异育银鲫免疫和抗氧化调控。3、凝结芽孢杆菌作用于异育银鲫的miRNAs调控分析利用高通量测序技术对BC0和BC500组异育银鲫肝脏进行miRNAs表达谱测序,通过生物信息学分析,挖掘潜在的差异表达miRNA,通过分析靶基因的生物学功能,以期探索凝结芽孢杆菌作用于异育银鲫的表观遗传机制。以BC0为对照,鉴定到BC500组779个差异表达miRNA,其中上调466个,下调313个;得到517个极显著差异miRNA,其中上调294个,下调223个。注释到6556个靶基因;差异miRNA靶基因GO富集分析表明,靶基因主要富集的Biological Process条目主要为转录调控（regulation of transcription）、蛋白磷酸化（protein phosphorylation）、代谢（metabolic process）、氧化还原反应（oxidation-reduction）和信号转导（signal transduction）等;主要富集的Cellular Component条目为细胞核（nucleus）、细胞质（cytoplasm）、细胞膜（membrane）、质膜（plasma membrane）和胞内（intracellular）等;主要富集的 Molecular Function 条目有金属离子结合（metal ion binding）、DNA 结合（DNA binding）、核苷酸结合（nucleotide binding）、锌离子结合（zinc ion binding）和核酸结合（nucleic acid binding）等,表明凝结芽孢杆菌主要影响转录调控、代谢以及细胞间信息传递等生命过程。KEGG富集分析发现摄食凝结芽孢杆菌主要影响了 MAPK信号及Wnt抗氧化及细胞骨架等信号调控。表明凝结芽孢杆菌主要调控异育银鲫的细胞过程、环境响应、代谢、遗传信息传递及机体调控。4、凝结芽孢杆菌不同投喂模式对异育银鲫生长、免疫及抗氧化的影响建立不同凝结芽孢杆菌日粮投喂模式,P1、连续投喂基础日粮,即对照组;P2、连续投喂500 mg/kg试验日粮;P3、连续投喂1000mg/kg试验日粮;P4、先投喂基础日粮5 d,后投喂500 mg/kg试验日粮2d;P5、先投喂基础日粮5 d,后投喂1000 mg/kg试验日粮2d;进行8周养殖实验。分析凝结芽孢杆菌对异育银鲫生长、生理生化、抗应激及抗氧化能力的影响。与P1组相比,P4和P5组提高了异育银鲫的末均重（FBW）、WGR和SGR,降低了 FCR;提高了呼吸爆发、髓过氧化物酶（MPO）和ASAFR活性;降低了 MDA含量;激活了 Nrf2-Keap1抗氧化信号,上调了 Prx2和NOX等应激蛋白的表达。结果表明,优化的凝结芽孢杆菌投喂模式提高异育银鲫生长性能、免疫及抗氧化性能。5、凝结芽孢杆菌对异育银鲫抗高密度应激的影响在上述试验基础上,设计高密度应激实验,探索不同凝结芽孢杆菌投喂模式（P1、P2、P3、P4和P5）是否能够缓解高密度应激诱导的应激胁迫。高密度应激48 h时,各实验组HSP70和Prx2的转录表达均显著低于对照组,表明凝结芽孢杆菌可有效降低高密度应激导致的异育银鲫氧化应激;P4组（500 mg/kg间隔投喂）相关血液免疫及血清抗氧化指标显著提高,血清葡萄糖含量升高;血清脂肪过氧化产物MDA显著降低;应激胁迫关键基因HSP70和Prx2表达下调;Nrf2-Keap1抗氧化信号相关基因表达有效缓解。结果表明,间隔投喂500mg/kg凝结芽孢杆菌能够缓解高密度胁迫诱导的代谢、免疫及抗氧化受阻。6、凝结芽孢杆菌对异育银鲫抗嗜水气单胞菌感染的影响在上述试验基础上,设计嗜水气单胞菌感染实验,探索不同凝结芽孢杆菌投喂模式（P1、P2、P3、P4和P5）是否能够缓解嗜水气单胞菌感染诱导的应激胁迫。与感染前相比,嗜水气单胞菌感染24 h和48 h后,P5组血清SOD活性降低,应激蛋白Prx2和NOX转录水平表达下调;P4组（500 mg/kg间隔投喂）免疫性能恢复到P1组水平,P5组（1000 mg/kg间隔投喂）抗氧化性能恢复到P1组水平。这表明间隔投喂500 mg/kg或1000 mg/kg凝结芽孢杆菌可有效降低感染嗜水气单胞菌对异育银鲫代谢、免疫及抗氧化的损伤作用。通过以上研究,发现凝结芽孢杆菌可提高异育银鲫的生长性能及免疫性能,且500 mg/kg间隔投喂效果较好,能显著提高鱼体抗应激、抗病原菌感染能力。因此,推荐凝结芽孢杆菌作为异育银鲫功能性饲料免疫增强剂。