论文部分内容阅读
背景肝癌是常见的恶性肿瘤之一,目前主要的治疗方法以手术、介入、放疗为主,而基因治疗有可能成为肝癌治疗的新手段。在肿瘤的基因治疗研究中,关键问题在于提高目的基因的靶向性。利用在多数肿瘤中特异性表达的启动子序列,驱动目的基因特异地在肿瘤细胞中表达,是解决肿瘤基因治疗靶向性问题的一个有效途径。survivin是IAP家族的新成员。Survivin组织分布的最大特点是具有明显的细胞选择性,其在胚胎及多种肿瘤细胞系中高表达,但是不表达于终末分化的正常组织。因此,研究者认为survivin启动子可用作肿瘤靶向治疗的工具,启动下游杀伤基因特异性表达于肿瘤细胞,从而避免损伤正常细胞。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosisfactor related apoptosis inducingligand,TRAIL）又称为Apo2L（ligand）,是Wiley发现的TNF超家族成员,Trail的最大特点是能够诱导多种肿瘤细胞及转化细胞凋亡而对大多数正常细胞无影响,而这一选择性杀伤特性也预示着Trail在肿瘤治疗中有广泛的应用前景。本研究我们拟构建含有Survivin340启动子及Trail全长cDNA的重组质粒。评价其在肿瘤细胞和正常细胞中诱导蛋白表达能力的差异以及诱导肿瘤细胞凋亡的情况。目的克隆人Trail cDNA基因和Survivin基因启动子,构建重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail,检测Survivin基因启动子在肿瘤细胞与正常细胞中诱导Trail蛋白表达能力的差异,并进一步检测重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail诱导肝癌细胞凋亡的情况。材料和方法1、主要材料:肝癌细胞株HepG2细胞,小鼠胚胎正常成纤维细胞3T3细胞,真核表达质粒pcDNA3.1（-）,pluc340质粒（含有survivin特异启动子的pGL3载体）,大肠杆菌TOP10感受态细胞。2、方法:2.1引物设计根据Trail及Survivin340启动子基因序列,分别设计了2对引物。Trail基因上游引物:5′-TCCGCTCGAGCCTCACTGACTATAAAAGAATAGAG-3′包含了XhoⅠ酶切位点;下游引物:5′-CCCAAGCTTGGGTTAGCCAACTAAAAAGGCC-3′包含了HindⅢ酶切位点。用该对引物扩增的PCR产物预期目的片段长度为955bp。Survivin启动子基因上游引物5′-GAAGATCTTCTCAAGTGATGCTCCTGCCTA-3′包含了BglⅡ的酶切位点,下游引物5′-TCCGCTCGAGTGTAGAGATGCGGTGGTCCT-3′包含了XhoⅠ的酶切位点。用该对引物扩增的PCR产物预期目的片段长度为423bp。2.2 Trail基因真核表达质粒的构建HepG2肝癌细胞（由本室常规培养保存）用含有100 mL/L新生牛血清的RMPI1640培养液常规培养。用Trizol（TaKaRa公司产品）提取总RNA,逆转录反应按试剂盒（fermentas公司）说明操作制备cDNA。取2μl cDNA用上游引物和下游引物进行PCR反应。反应条件:预变性94℃15s,变性94℃30s,退火53℃30s,延伸68℃75s,32个循环,终末延伸68℃5min。所得目的片段用限制性核酸内切酶XhoⅠ和HindⅢ双酶切后插入pcDNA3.1（-）的XhoⅠ和HindⅢ多克隆位点之间,所得质粒命名为pcDNA3.1/Trail,进行测序。2.3含有Survivin340启动子的重组质粒构建克隆Survivin340启动子基因,以pluc340为模板（本实验室保存）,利用上下游引物进行PCR反应,扩增条件如下:预变性94℃15s,变性94℃30s,退火56.5℃30s,延伸68℃75s,30个循环,终末延伸68℃5min。对所得目的片段及之前构建好的重组载体pcDNA3.1/Trail分别用限制性内切酶BglⅡ和XhoⅠ双酶切,将酶切后产物纯化后用T4连接酶进行连接,所得质粒命名为pcDNA3.1/SurP/Trail,进行测序。2.4脂质体的转染在转染前一天,将HepG2细胞与3T3细胞两组细胞分别转至6孔培养板中,浓度为2x105个/ml。当细胞融合约80%,用lipofectamine-LTX转染试剂盒将已构建好的重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail导入HepG2及3T3细胞中。转染72小时提取两组细胞的总蛋白,用Western Blot检测两组细胞Trail蛋白表达的差异。2.5重组质粒的鉴定用细胞裂解液RIPA和PMSF溶解细胞,12000xg离心30min去残渣,BCA法蛋白定量,约50μg蛋白加入2xSDS上样缓冲液96℃变性10min。12%聚丙烯酰胺凝胶电泳,印迹转染醋酸纤维膜。用含5%脱脂奶粉的TBST溶液在室温下封闭2h以去除非特异结合部分,加入抗TRAIL抗体于4℃过夜。加入辣根过氧化酶标记的二抗室温下孵育1h后,用Western Blot Chemiluminescence试剂盒检测两组细胞Trail蛋白的表达。2.6半定量RT-PCR检测pcDNA3.1/SurP/Trail重组质粒转染后Trail mRNA表达将HepG2细胞分为3组细胞,培养于6孔板各一个孔中,第一组转染pcDNA3.1/SurP/Trail重组质粒,定义为重组质粒组;第二组转染pcDNA3.1（-）空白载体,定义为空白质粒组;第三组未转染任何质粒,定义为未转染组。转染24小时后提取各孔细胞的总RNA,行半定量RT-PCR检测各组不同处理的细胞中Trail mRNA的表达情况。2.7双标记流式细胞术分析细胞凋亡将HepG2细胞分为3组,分组同2.6项。转染pcDNA3.1/SurP/Trail重组质粒48小时后收集各组细胞,参照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒提供方法,处理细胞后用双标记流式细胞术分析各组细胞的凋亡率。2.8统计学分析用SPSS13.0软件进行分析,结果以mean±SD来表达,两组比较采用独立样本t检验;三组比较采用单向方差分析（One-way ANOVA）,组间多重比较采用Bonferroni方法分析,并且当P＜0.05时认为差异具有统计学意义。结果1、Trail真核表达质粒的构建通过RT-PCR获得了约955bp的Trail基因片段,并成功地构建了Trail的真核表达质粒pcDNA3.1/Trail,经测序Trail基因序列与GenBank公布的一致。2、含有Survivin340启动子的重组质粒构建以pluc340为模板克隆Survivin340启动子基因,利用pcDNA3.1/Trail质粒成功构建了含有Survivin340启动子的重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail,经测序Survivin340启动子基因序列与模板完全一致。3、重组质粒的鉴定以HepG2肝癌细胞与3T3小鼠胚胎成纤维细胞两种细胞为对照,转染pcDNA3.1/Trail质粒后,两组细胞Trail蛋白的表达未见明显差异,见图6,两组间行独立样本t检验,t=-0.580,P=0.593,两组差异无统计学意义。而用重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail分别转染两种细胞,Western Blot检测结果表明Trail蛋白在两种细胞中的表达有差异（图7）。两组间行独立样本t检验,t=13.677,P=0.000,两组差异有统计学意义。4、半定量RT-PCR检测pcDNA3.1/SurP/Trail重组质粒转染后Trail mRNA表达。三组不同处理的细胞的RT-PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳（1.0%琼脂糖凝胶电泳80V,时间:30min）可见1000bp左右有明显条带,其中转染pcDNA3.1/SurP/Trail质粒组PCR产物浓度明显高于另外两对照组,而空白质粒组与未转染组差异不明显。（图8）（图片为3次独立实验中的一次结果,另2次实验结果相似）。三组比较采用单向方差分析（One-way ANOVA）,组间多重比较采用Bonferroni方法。结果重组质粒组与空白质粒组比较,P=0.001,两组差异有统计学意义;重组质粒组与未转染组比较,P=0.000,两组差异有统计学意义;而空白质粒组与未转染组比较,P=1.000,两组差异无统计学意义。5、双标记流式细胞术分析细胞凋亡转染pcDNA3.1/SurP/Trail重组质粒组的HepG2细胞凋亡率明显高于另外两组。而空白质粒组与未转染组差异不明显,见图9。三组比较采用单向方差分析（One-way ANOVA）,组间多重比较采用Bonferroni方法。结果重组质粒组与空白质粒组、重组质粒组与未转染组比较,均得出P=0.000,差异有统计学意义。而空白质粒组与未转染组比较,P=0.404,差异无统计学意义。结论本研究中通过分子克隆技术,成功克隆了Trail cDNA基因及Survivin启动子基因,并成功构建重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail,通过Western blot检测到重组质粒在HepG2癌细胞中特异生物活性较在3T3正常细胞中强,能明显诱导Trail蛋白的表达,诱导肝癌细胞凋亡。本实验为肿瘤的基因治疗探索新的治疗方法。研究结果可望提高临床肝癌治疗的疗效,提高患者的生存率及生活质量,为人类造福;新型基因治疗载体可作为基因治疗药物,有望申报专利,进行技术转让,产生直接经济效益。