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毛白杨(Populus tomentosa Carr.)作为中国重要的经济林木在造纸和建筑中具有非常重要的作用。而木本植物(包括毛白杨)维管组织中次生木质的发育是木材生产的生物学基础。研究表明,维管组织的形成依赖于形成层细胞连贯而有序的活动,并受到诸多内源因素和外部环境因素的共同调节和影响。尽管近年来内源性激素信号和转录因子调控木材发育的研究取得了很大进展,但能量状态信号是否影响树木次生木质部发育目前尚不清楚。作为真核细胞有氧呼吸的主要场所,线粒体通过影响能量代谢进而参与细胞行为的调节,例如增殖、分化和凋亡。同时,线粒体信号传导可能在植物生长发育、对外界刺激的反应及对环境变化的适应中均起着重要作用。最近的研究表明,线粒体功能障碍会导致生长素的变化,但线粒体如何通过生长素调节植物发育的具体机制仍不清楚。MicroRNA(miRNA)是内源的单链非编码RNA,长度约为16-29个核苷酸(nt),它们参与植物和动物中转录后基因表达的调控。大量研究表明,miRNA在植物生长发育过程中起着重要作用。课题组前期筛选到一个杨树特异MircoRNA-PtoMIR476a,通过转基因技术,获得PtoMIR476a过表达植物及其下游靶基因PtoRFL26的过表达转基因植株,观察到PtoMIR476a过表达导致转基因植物茎干形成层层数明显增加,木质部占比则显著减少,表明该基因参与了维管次生生长发育的调控。本论文以毛白杨为研究对象,对PtomiR476a在调控茎干次生维管组织中的生物学功能进行了系统研究。具体的研究结果如下:1.通过荧光定量PCR与启动子GUS染色分析发现,PtomiR476a在毛白杨所有组织中组成型表达,但在茎中表达量较高。且过表达PtoMIR476a导致转基因植物茎中形成层细胞层数显著增加,木质部细胞层数减少,同时木纤维细胞与导管细胞面积以及导管细胞密度均显著增加。因此推测,PtomiR476a可能参与调控形成层向木质部的分化,并促进木纤维细胞与导管细胞的膨胀;2生物信息学以及降解组分析显示,11个PENTATRICOPEPTIDE REPEAT(PPR)-Restorer of Fertility Like(RFL)家族的基因为PtomiR476a的潜在靶基因。通过检测上述11个潜在靶基因的表达水平,发现过表达PtoMIR476a转基因植株中PtoRFL26下调最为显著,因此,选取PtoRFL26作为PtoMIR476a直接的下游靶基因进行进一步研究;3.对PtoRFL26进行组织表达分析发现其主要在茎中表达,进一步通过在线网站AspWood(http://aspwood.popgenie.org)与原位杂交分析证实,PtoRFL26在维管形成层中特异性高表达。通过分析过表达PtoRFL26转基因植株发现,其维管形成层细胞层数显著减少,但木质部细胞层数增加,同时木质部的纤维细胞和导管细胞明显减小。因此推测,PtoRFL26可能促进形成层向木质部的分化,而抑制木纤维细胞和导管细胞的膨胀;4.半定量PCR分析发现,过表达PtoMIR476a与PtoRFL26均使得线粒体许多基因的转录水平受到影响。进一步对转基因毛白杨植株中辅酶Ⅰ(NADH/NAD+)、ATP和H2O2含量进行检测发现,PtoMIR476a过表达转基因毛白杨植株中,辅酶Ⅰ(NADH/NAD+)与ATP的含量显著高于野生型,而H2O2的含量显著低于野生型。PtoRFL26过表达转基因毛白杨植株则呈现相反的结果。上述结果都表明,PtomiR476a促进线粒体的代谢功能,而过多的ptoRFL26抑制线粒体的正常代谢;5.为了解析Ptomi R476a/PtoRFL26影响次生维管组织发育的机制,对野生型与PtomiR476a过表达转基因植株进行转录组测序,分析显示在PtomiR476a过表达导致形成层发育相关的转录因子编码基因WOX4/5/11、AIL1及CYCD3.1的表达水平均出现了明显的上调,荧光定量PCR对其进行验证亦得到类似结果。6.前人研究表明,线粒体功能的紊乱会影响生长素信号通路。采用荧光定量PCR对转基因植株中生长素信号通路相关基因的表达水平进行检测。结果表明,在过表达PtoMIR476a转基因植株中,生长素合成及转运相关基因均呈上调趋势,而过表达PtoRFL26转基因植株中这些基因的表达则呈显著下调。同时,利用线粒体抑制剂鱼藤酮(Rotenone)对野生型植株进行处理后发现,生长素相关转运基因的表达明显下调,生长素含量下降约15.3%。进一步通过DR5-YFP报告株系发现生长素信号在形成层的强度及相邻区域位置大量积累;而在鱼藤酮处理后形成层中生长素信号消失。上述结果均表明,线粒体功能的紊乱会影响生长素的合成与转运,进而影响杨树茎中次生维管组织的发育。本论文结果初步证实,PtomiR476a靶向调控PtoRFL26,后者通过影响线粒体中复合体I的部分编码基因,扰乱线粒体稳态,进而通过生长素信号通路影响毛白杨茎干维管组织的次生生长。综上所述,本论文揭示了线粒体在毛白杨木材形成的过程中发挥着重要调控作用,为杨树木材形成研究提供了新的思路,为林木新品种改良提供了一条新的途径。