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热应激是我国南方地区最主要的应激性致病因素,给养猪业带来了巨大的经济损失。从长远来看,选择具有较强抗应激能力的品种(系)是解决这一问题的有效途径。但由于对热应激致病的机理尚不清楚,抗应激基因素材的挖掘也不深入,大大限制了选育技术的进一步发展。细胞因子信号传导抑制因子(Suppressor of cytokine sig-naling,SOCS)是细胞因子信号通路的负调节因子,能通过负反馈而抑制细胞因子的信号传递,在多种疫病中发挥重要作用,推测其可能参与了热应激的调控过程。鉴于此,本研究:克隆了猪SOCS1和SOCS2 cDNA ORF序列,并分析其分子结构特征。检测了SOCS1/2在热应激猪不同组织的表达谱;构建了SOCS1/2和HSP70(以转染HSP70方式构建猪巨噬细胞的体外热应激模型)的真核表达载体pcDNA3.1-V5-SOCS1、pcDNA3.1-V5-SOCS2、pcDNA3.1-V5-HSP70,与NF-κB启动子报告基因共转染293T细胞和CRL-2845细胞,分析对NF-κB活性的影响;构建干扰RNA载体(shRNA)并共转染,分析SOCS1/2沉默对NF-κB的活性的影响,从而阐述SOCS1/2的功能,为抗热应激猪的分子育种提供基因素材。研究结果表明:(1)SOCS1编码基因全长832 bp,开放阅读框长(ORF)663 bp,编码220个氨基酸。预测蛋白分子量为24.4 kDa,等电点(PI)为11.07。与人、牛、小鼠、犬和马SOCS1的氨基酸序列同源性分别为97.6%、95.9%、94.3%、91.7%和90.9%。蛋白分子具有家族特异性的中央SH2区、C末端40个氨基酸的SOCS Box区及KIR结构区。热应激条件下在各组织的表达结果显示,脾脏、小肠和胸腺中SOCS1 mRNA的表达显著上调(P≤0.05),且呈时间依赖性。但在肠系膜淋巴结中,热应激第3、6和9天显著下调(P≤0.05)。NF-κB活性检测结果表明,猪SOCS1负向调控HSP70介导的NF-κB的活化,且TNF-α能使这种活化作用放大。Western blot结果显示,SOCS1通过降解Mal蛋白的表达,抑制了IκB-α的磷酸化而负向调控HSP70介导的NF-κB活化。2)SOCS2编码基因全长822bp,开放阅读框长(ORF)597 bp,编码198个氨基酸。预测蛋白分子量为22.25 Da,等电点(PI)为8.53。与GenBank中登录的普通猪、牛、人和小鼠SOCS2序列同源性分别为99.9%、97.5%、96.0%和94.4%。其具有1个中央SH2域(Scr-homology 2)、1个长度可变的N端结构域和1个位于C端包含40个氨基酸残基的保守序列(SOCS盒)。热应激条件下在各组织的表达结果显示,SOCS2在脾脏和肠系膜淋巴结中的表达极显著下调(P≤0.01),且呈时间依赖性。而小肠中SOCS2 mRNA的表达显著上调,且第6天达到峰值(P≤0.01)。NF-κB活性检测结果表明,猪SOCS2负向调控HSP70介导的NF-κB的活化,且TNF-α能使这种活化作用放大。Western blot结果显示,SOCS2通过降解Mal蛋白的表达,抑制了IκB-α的磷酸化而负向调控HSP70介导的NF-κB活化。该研究成功克隆了猪SOCS1和SOCS2基因,发现其有明显的热应激响应,并呈组织和时间依赖性。SOCS1/2通过降解Mal而抑制IκB-α的磷酸化,从而负向调控HSP70介导的NF-κB活化。